培养材料消毒和接种专家讲座

一、试验目标1、掌握植物组织培养中无菌操作技术2、掌握植物外植体表面消毒常规方法培养材料消毒和接种专家讲座第1页操作前准备工作接种室在接种前4-5d必须通风换气。在接种前一天对接种室进行全方面消毒，普通用40%福尔马林进行全方面喷雾，并密闭24h，然后打开换气窗10-15min.。

培养材料消毒和接种专家讲座第2页A:试验器具和材料准备

B:用75%酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台面上用具不要放置太多或重合放置，以免降低灭菌效果。

C:关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有尤其情况，尽可能不要下工作台）

培养材料消毒和接种专家讲座第3页D:用70－75％乙醇消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。

注意：全部操作应在火焰近处并经过灼烧进行。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。

培养材料消毒和接种专家讲座第4页接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中

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培养材料消毒和接种专家讲座第5页整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要快速

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培养材料消毒和接种专家讲座第6页接种过程中尽可能到达悬空要求预防操作带来污染

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培养材料消毒和接种专家讲座第7页培养器材清洗与灭菌在细胞工程试验中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒性物质包含解体微生物和细胞残余物以及非营养化学物质。一些化学物质仅0.01μg/L就会对细胞产生毒性作用，所以对培养器皿清洗是组织培养中一项极为主要步骤。培养材料消毒和接种专家讲座第8页A、新购置玻璃仪器表面常附着有游离碱性物质，可先用0.5％去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在1％～2％盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最终用无离子水冲洗两次，在100℃～120℃烘箱内烘干备用。

培养材料消毒和接种专家讲座第9页B、使用过玻璃仪器清洗

先用自来水洗刷至无污物，再用适当毛刷沾去污剂（粉）洗刷，然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用。清洗后器皿内外不可挂有水珠，不然重洗.C、金属用具洗涤

金属用具普通不宜用各种洗涤液洗涤（新能够用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，普通用酒精擦洗，然后火焰干燥

培养材料消毒和接种专家讲座第10页（1）干热灭菌

适合用于玻璃器皿和金属器械灭菌。操作方法：150℃、40min（2）湿热灭菌

适合用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。121℃维持20~30min

培养材料消毒和接种专家讲座第11页（3）过滤灭菌培养基中一些成份碰到高温分解（如一些生长调整剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。灭菌方法：将生长调整剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50℃左右时，加入适量激素。培养材料消毒和接种专家讲座第12页（4）射线灭菌

主要是利用紫外灯进行照射，适合试验室空气、操作台等，灭菌时间20-30min。

注意：关灯后5min后再进入。超净工作台关灯后要打开风机、（5）火焰灼烧灭菌

用火焰灼烧到达灭菌目标，适合用于接种器皿灭菌。

培养材料消毒和接种专家讲座第13页（6）消毒剂

适用外植体、试验器皿、操作表面、皮肤等。

几个惯用消毒剂效果比较消毒剂使用浓度(%)消毒时间(min.)效果残液去除难易乙醇70-750.1-3好易新洁尔灭10～205～30好易氯化汞0.1～12～15最好最难过氧化氢10～125～15很好最易抗菌素4～50mgl-130～60很好较难次氯酸钙/纳9～105～30好易培养材料消毒和接种专家讲座第14页二、试验原理用于进行组织培养组织、器官和细胞称为外植体。在组织培养中，外植体假如是带菌，在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功最基本和主要前提。惯用消毒剂对外植体进行消毒。从室外取材料，普通先用自来水冲洗数分钟.培养材料消毒和接种专家讲座第15页接种材料使用消毒剂后，要用无菌水洗涤3～5遍，最终用无菌纸擦洁净。使用消毒剂标准是既要到达消毒目标，又不能损伤植物组织和细胞，还要符合就地取材标准。对一些轻易污染、较难灭菌外植体进行表面消毒时，用单一消毒剂不能收到好效果，所以常选取两种消毒剂交替浸泡法。培养材料消毒和接种专家讲座第16页普通，首先用75％乙醇浸泡外植体数秒钟至30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min或含有2％活性氧次氯酸钠溶液5～30min，然后用无菌水洗涤。有时在氯化汞或次氯酸钠灭菌后，用无菌水洗，深入剥去几层组织或器官如叶片后，再用次氯酸钠灭菌3～5min，无菌水漂洗3次后，切割、用于接种。

消毒溶液对外植体消毒是在超净工作台上进行。完成表面消毒接种材料要尽快放置于培养基中。

培养材料消毒和接种专家讲座第17页三、试验材料器材：超净工作台、镊子、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿。药品及材料：0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、绿豆种子、培养基。培养材料消毒和接种专家讲座第18页四、试验步骤（1）准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。（2）将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，照射最少20分钟，关闭台内紫外灯，通风五分钟后，再开日光灯进行无菌操作。（3）接种前用肥皂洗手，尤其是将手指洗净，然后用沾有75%酒精棉球把手消毒一次。（4）将绿豆种子在流水下冲洗洁净。培养材料消毒和接种专家讲座第19页（5）将种子放于广口瓶中，用75%酒精溶液浸泡30s，无菌水冲洗，然后用0.1%升汞溶液浸泡3、5、10min，期间不停摇动溶液，用无菌水洗涤5遍待用。（6）取出培养皿，有必要话能够用沾有75%酒精棉球把皿表面擦一下。培养材料消毒和接种专家讲座第20页（7）接种用镊子使用前插入95%乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧片刻，冷却后待用。也能够插入培养基边缘促使其冷却。培养材料消毒和接种专家讲座第21页（8）在酒精灯火焰旁揭去培养皿封口膜，在靠近火焰处，右手用灭菌镊子夹取绿豆种子，将其放在培养基上，用镊子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。每瓶可放8-12个外植体。（9）封上封口膜，标上接种日期、材料名称、姓名等，将接种材料移到培养室培养。培养材料消毒和接种专家讲座第22页培养材料消毒和接种专家讲座第23页