大肠杆菌分子克隆载体专家讲座

第三节

大肠杆菌分子克隆载体大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第1页一、E.coli克隆载体种类1.质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。2.噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。3.COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段，以利于体外包装4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第2页二、质粒与质粒载体

1.E．coli质粒种类

1)colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型。2)R因子（抗药性因子）

可接合转移DNA，属低拷贝严紧型，质粒较大，操作不便3)F因子（性因子）大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第3页2.质粒特点1)

质粒DNA复制与染色体复制无关2)

质粒DNA以超螺旋形式存在3)

质粒DNA能够接合转移4)

质粒不相容性和不相容群5)

质粒DNA消除—化学和物理法(吖啶染料，EtBr，高温等)6)

质粒整合—F因子又可整合到E.coli染色体中

3.质粒DNA转移

1）质粒DNA转移过程

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第4页质粒自主转移过程

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第5页质粒DNA转移和复制

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第6页

2）质粒转移必备条件ⅰ.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时复制起点—顺式作用（cis-action）ii.细胞从属物—性纤毛，由蛋白质组成—反式作用ⅲ.转移过程所需全部酶类—反式作用3）质粒转移类型ⅰ.自我转移（Self-transmissible）ⅱ.辅助转移（Donation）—可转移质粒仅具备oriT，若无辅助质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可提供全部反式作用蛋白质，前者便会发生接合转移。ⅲ.重组转移（conduction）—若质粒无oriT，该质粒只有整合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移。所以，用于克隆外源DNA分子克隆载体，只要具备oriT即可，另外两类功效基因可置于辅助质粒上，该质粒普通没有oriT，因而能够降低后者进入另一个细胞频率。

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第7页质粒自主转移质粒辅助转移质粒重组转移

R-重组DNA分子

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第8页

4.质粒DNA复制和调整控制

1)复制机制—复制方向、终止和方式

2)质粒拷贝数控制—抑制剂模型：高拷贝质粒需高浓度抑制剂，低拷贝质粒需低浓度抑制剂，同一不相容群质粒产生抑制剂可交叉相互作用。3)

质粒复制调控机制例子:ColE1质粒复制及复制起点结构

Borosetal.(1984)分离到一个pBR322突变体，其拷贝数可达1000/cell或65%总DNA，原因是在RNAI基因3'端附近发生一次G→T颠换。大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第9页ColE1质粒复制起点结构质粒DNA复制过程

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第10页5.大肠杆菌质粒载体

1)惯用质粒载体复制子

质粒载体复制子起源拷贝数

pBR322系列pMB115-20pUC系列pMB1500-700pACYC系列p15A10-12pSC101系列pSC10125colE1colE115-20

2)质粒载体惯用遗传标识基因

AprCmrKanrNeorTcrHygrLacZLacZα

3)多克隆位点区

大多数从pUC系列中多克隆位点衍生出来

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第11页

6.实例—pUC18和pUC19

pUC系列质粒载体由Messingetal.构建，含有三个显著特点：1）分子量小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大2）易于检测是否有外源DNA插入标识基因LacZα3）多克隆位点区

ⅰ.多克隆位点成对地存在于pUC18和pUC19中，位点排列次序相同，但方向相反。这种排列方式有利于外源DNA克隆和定向插入ⅱ.产生不一样末端规律排列:两端限制酶位点产生5’—突起端（EcoRI和HindⅢ），与之相邻两个限制酶位点产生3’—突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI），中央四个限制酶位点产生5’—突起端或平端。这种排列方式十分有利于插入DNA片段单向缺失和缺失片段回收。大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第12页pUC18和pUC19载体大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第13页如插入片段5’段定向缺失:XbaI→SphI→ExoⅢ→S1→T4DNAlingase;插入片段3’-端亦可采取类似方法进行缺失（SmaI→SstI→ExoⅢ→S1→T4DNAlingase）不一样载体中多克隆位点区能够供不一样目标片段重组。又比如:pBS+多克隆位点区排列次序是(见图)：假设有一EcoRI→HindⅢDNA片段，并要求在其3’-末端或5’-端接上另外DNA片段（如终止子、开启子），显然，pUC系列载体多克隆位点区是不太适宜，但选取pBS+中多克隆位点区就能满足要求。

ⅲ.多克隆位点集中排列，有利于克隆片段物理图谱绘制。除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表示外源基因（LacZα开启子）。大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第14页pBS载体结构大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第15页

三.

噬菌体载体

1.噬菌体λ载体

1）λ结构和特点

i.普通结构：48,502bp，线状ds-DNA，两端含有12n.t5‘-突起（5’-GGGCGGCGACCT-3’）该末端称为cos位点，可被λ编码末端酶所识别（该酶由λ末端两个基因Nul和A编码蛋白gpNul和gpA组成）ii.基因结构—46个基因，分为以下四类：ⅰ)调控基因：CⅢ、N、CI、Cro、CⅡ—决定进入溶源化还是裂解状态ⅱ)DNA复制：O、P、Qⅲ)λ重组：int、xis、redβ和gamⅳ)噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头(A-F)、尾(E-J)、S&R（细胞裂解）λ中部约1/3DNA(b2)与λ存活无关。大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第16页大肠杆菌λ噬菌体基因和表示调控大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第17页

2)λ噬菌体基因表示

i.最早期转录：转录起始于CI基因两侧PL和PR开启子，止于N和Cro末端tL和tR1，有右向转录物可継续经过O和P止于tR2。ii.后早期转录：N蛋白可使宿主细胞转录终止因子ρ失活，造成转录经过tR1、tR2和tL进入其余早期基因区域。iii.后期转录：cro蛋白可与OL和OR结合，阻止RNA聚合酶与PL和PR结合，转录终止，此时已合成了足够多控制蛋白Q，它对P'R起激活作用，造成后期基因转录。iv.DNA复制：因早期转录获DNA复制蛋白O和P，双向复制开始。v.包装：Nul和A蛋白与λDNAcos位点识别与切割，FI蛋白促进DNA进入头部蛋白，DNA充满后，gpw和gpFⅡ将头部封住，然后与尾部相连，形成噬菌体颗粒。大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第18页vi.裂解：基因R和S产物形成，细菌细胞裂解，噬菌体颗粒释放。vii.溶源反应：CⅡ和CⅢ基因产物分别激活PE和PI左向转录，致使CI和int基因表示，CI产物可阻止早期转录，造成后期基因表示受阻。对于裂解反应和溶源反应选择，取决于感染细胞中一系列宿主和噬菌体因子间错综复杂精细平衡关系。*当λDNA注入宿主细胞后，线状DNA首先环化为环状DNA，这种环化有以下几点好处：a.若为单向复制，不论从何处开始复制，全基因组均可全部复制b.噬菌体DNA插入宿主染色体DNA，只需一次位点特异性重组c.拓扑异构酶易于对其进行不足和过分加旋d.受损基因组增大了存活可能性，因为双向复制不会受阻于损伤DNA链，而单向复制就不能经过

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第19页

3)λDNA复制大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第20页4)λDNA包装过程l

头—尾连接器由12分子gpB组成中空结构，groE1和groES负责装配l

pX由10个杂合gpC和gpE组成，使连接器定位l

gpW和gpFⅡ结合在连接器上，预防DNA外泄，提供尾部粘着点末端酶由两基因产物组成（Nul和A），gpNul2-gpA1(20,444x2+72,280=113,168)

该酶含有以下各种酶活性：1）特异DNA位点结合；2）特异位点切口形成；3）头前体结合；4）gpFI结合；5）cos位点变性；6）DNA转位；7）DNA序列扫描；8）ATP结合；9）ATP水解。

所以，头部蛋白gpE和gpD以及包装蛋白gpA是λDNA形成噬菌体颗粒必不可少组分，体外包装物制备就是依据这一结论

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第21页λDNA包装

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第22页

5）λDNA作载体缺点和处理方法

i.λ头部只能容纳本身DNA78-105%，即39-52.5Kb，天然λ仅可插入3Kb外源DNA片段—除去全部与λ裂解无关基因和空白区，最大可插入22Kb。ii.同一个限制酶含有多个识别位点，不利于外源DNA插入—体内突变和建立新克隆位点。ⅲ.重组λDNA分子难于直接导入宿主细胞—利用体外包装成病毒颗粒，然后经过感染方法注入DNA。

6)λ载体种类

i.插入型—即将外源DNA直接插入已构建载体中，如λgt11，能够插入长达7KbDNA。这类载体被限制酶切成左右臂。ⅱ.取代型—即利用一段外源DNA去取代载体中一段DNA，而这段DNA常含有一定标识基因。这类载体常被限制酶切为三段：左臂、隔离段和右臂。*有取代型λ载体亦可用作插入型载体,如Charon4A大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第23页大肠杆菌λ载体Charon4ASpi重组子筛选

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第24页7)λ载体遗传标识基因和重组子筛选

因为λ载体或重组DNA是经过感染路径进入宿主细胞，因而形成噬菌斑就是一个显著标识。用于重组子检测遗传标识基因主要有lacZ基因。不论是用插入或取代法，该标识基因均会失活。

利用spi-选择重组子：野生型λ不能在P2溶源化菌种中成活，称之为spi+(sensitivetoP2interference)，这与red和gam基因相关。若用外源DNA将这些基因取代，形成重组DNA分子可在P2菌中株中存活，并形成噬菌斑。λ载体λ1059、λL47.1均属这类，这种选择方式亦称之为显性选择。大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第25页

2.P1噬菌体载体1)

基本结构与特征

i.

基因组长88kb,在噬菌体颗粒中DNA长100kb,呈线状,其中约有12%多出DNA;ii.

能够低拷贝质粒形式存在于细菌细胞中,又能够烈性噬菌体形式进行复制;

iii.P1噬菌体包装原理:渐进满头机制（processiveheadfulmechanism）底物:滚环复制过程形成头尾相连串状体

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第26页包装过程:始于一个长162bpP1pac位点，识别和切割此位点是P1编码pacase，切出pac一端进入预制头部，当其头部充满DNA后，DNA再次被切。第二次切割是随机，无特异性DNA序列。第二轮包装则从非特异性切割出末端开始。所以，屡次包装都是从一个pac位点开始。P1头部可容110Kb。

pac位点:一端含4个六聚体(5’TGATCA/G3’)，另一端则有三个，中间区域长90bp，pacase切点位于靠近90bp区中心序列。每个六聚体都有一个腺嘌呤甲基化位点(dam→GATC),pacase只作用甲基化pac位点.大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第27页

大肠杆菌P1噬菌体基因组和包装大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第28页2)P1载体---pAd10sacBⅡ

i.优点i)

可克隆较大插入片段,可插入95Kb外源DNA，二倍于cos质粒载体ii)

较高转化频率,1~2μg载体+2~4μg外源DNA→105转化子iii)

与YAC载体相比，它易于产生多拷贝基因组片段;易于取得大量特定克隆DNA;克隆过程更可靠;克隆片段易于进行次克隆

ii.结构载体被二个loxP重组位点分隔为两区—Ampr和Kanr区Ampr区：来自pBR322ori,pac位点(反时针包装),来自腺病毒11Kb填充片段(插入到ScaⅠ位点)Kanr区：Kanr(Tn903)和Tetr基因，P1质粒复制子和分离系统，P1裂解复制子，其活性受lac操纵基因开启子控制大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第29页大肠杆菌P1噬菌体载体pAd10sacBⅡ

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第30页P1噬菌体载体构建基因组文库示意图pAd10sacBⅡScaI+BamHI长臂+短臂加入外源DNA片段重组DNA分子离体包装感染宿主细胞大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第31页

SacB基因:编码一个将蔗糖转化为果聚糖酶，当含该基因细胞培养在2%以上蔗糖培养基中时,果聚糖积累在细胞周质空间内，造成大肠杆菌细胞死亡

SacB基因被克隆到原Tetr基因BamHI-SalI间,在其上游加上E.coli基因开启子,克隆位点BamHI位于这两个DNA片段间,外源DNA片段插入时可进行显性筛选重组子为了使sacB基因自发突变减小到最小程度,sacB基因上游还有一个P1C1阻遏物结合位点与其开启子重合。凡是表示P1C1基因细胞，sacB基因表示受阻，在无蔗糖条件下，这种细胞会生长得更加好iii.克隆策略3.3kb短臂：含pac,loxP,无开启子sacB26kb长臂:含P1裂解复制子，Kanr，P1质粒复制子，loxP位点大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第32页包装:重组DNA分子先用pacase或抽提物Ⅰ酶切pac位点，然后用抽提物Ⅱ（含头部和尾部）进行包装直至头部充满DNA，最终与尾部相连成有感染力重组P1噬菌体颗粒。iV.

重组DNA分子形成当重组DNA分子进入宿主细胞后，特异性位点重组发生在两个方向相同loxP位点，该过程由宿主细胞表示重组酶（Cre）催化v.宿主菌

E.coliNS3529菌株基因型recA-，lacⅠq，mcrABC，mrr:recA-:预防插入DNA片段内同源重组，以免发生重排;lacⅠq

:抑制P1裂解复制子激活,使P1质粒复制子在细胞中以单拷贝形式存在，亦预防外源DNA分子重排;

mcr和mrr:抑制富含GpMeC或ApMeC插入片段选择性丢失大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第33页

3.M13和fd载体

1)

结构特征—环状ssDNA，病毒颗粒呈丝状2)

复制过程：ss（+）RF(0-1min)RFRF(0-20min)RFss(+)(20min→∞)DNA包装无严格限制

3)生活史a.

病毒粒子靠小分子衣壳蛋白和A蛋白附着于性纤毛顶端（E.coli中F因子提供）b.

病毒DNA和A蛋白进入细胞内，大部分衣壳蛋白则留在细胞膜上c.

病毒DNA变为双链复制形式（RF）,衣壳蛋白可能为DNA复制提供附着位点d.

RF进行滚环复制，形成单链，同时基因与蛋白质结合e.

ssDNA环化，并形成线状DNA—基因与蛋白质复合物f.

病毒DNA穿膜时，基因与蛋白质被附着于膜上衣壳蛋白取代，完整病毒从细胞中释放，释放时不杀死细胞，但因感染细胞生长迟缓，依然可见噬菌斑大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第34页M13噬菌体生活史

大肠杆菌分子克隆载体专家讲座第35页

1）基因结构基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ编码特异性蛋白质，参加病毒颗粒组装基因Ⅱ参加DNA复制基因Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ编码M13结构蛋白基因Ⅴ参加单链复制过程中环化作用基因Ⅵ是衣壳蛋白主要组成部分

2）M13mp系列载体a.

特点：在IR区中插入一个lacZα基因，然后在该基因中逐步构建一个多克隆位点区，ds-DNA可用常规方法直接导入，ss-DNA惯用感染方法噬菌斑形成用于选择DNA导入细胞，在X-Gal平板上形成无色噬菌斑检测重组子b.

优点：易于取得ss-DNA用于DNA序列测定和基因突变，从细胞中易于检测分离到RF型ds-DNA用于外源DNA重组M13mp系列载体多