免疫组化概论抗原抗体

免疫组化概论抗原抗体免疫组化概论抗原抗体第1页

学习本章节总体要求

*1.熟悉免疫组织化学技术特点及其原理

*2.掌握免疫组织化学染色操作流程

*3.熟悉免疫化学反应相关术语及其所用免疫试剂起源和质量控制

4.了解多克隆抗体制备程序与操作要求

5.了解单克隆抗体制备原理和步骤

免疫组化概论抗原抗体第2页概论

一、什么是免疫组织化学

免疫组织化学是应用免疫学和组织化学原理，对细胞组织标本中一些多肽、蛋白质等大分子物质进行定性、定位、定量研究一门科学。免疫组化概论抗原抗体第3页

这项技术本质上是一个染色及原位示踪技术，它是在酶组织化学基础上发展起来，始于20世纪中期。二、发展历史免疫组化概论抗原抗体第4页免疫荧光标识抗体技术---Coons1940年

免疫酶标抗体技术---Abakane1963

不标识酶抗体（酶抗酶复合物）技术---Sternberger1970

胶体金免疫标识技术和亲和标识技术---Hsu1985免疫组化概论抗原抗体第5页

免疫试剂，自1975年Kohler和Milstein创造了单克隆抗体制备杂交瘤技术后，已从采取多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代。当前商品供给特异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多数都为单克隆抗体。免疫组化概论抗原抗体第6页1.特异性强专一

2.敏感性高检测阈值达ng或pg水平

3.定位准确既可定性、定位，又可定量

4.三位一体形态、功效和代谢三结合

缺点：干扰多，易出现假阳性

三、技术特点（优点）免疫组化概论抗原抗体第7页

（一）

组织处理与切片选择（二）免疫染色前处理试剂准备（示踪，放大，标识）消化阻断*（三）免疫组化染色原理、优缺点、流程（四）免疫染色后处理增强、衬染、封固

四、免疫组织化学染色操作步骤免疫组化概论抗原抗体第8页*（五）结果判断与对照设置

方法众多

敏感不一样

程序雷同

按需选取

关键步骤：特异抗体-----桥联抗体----标识抗体种系必需匹配（第一抗体）（第二抗体）（第三抗体）

免疫组化概论抗原抗体第9页第一节抗原和抗体免疫组化概论抗原抗体第10页一、抗原：凡能刺激机体产生特异性免疫应答（免疫原性），并能与对应免疫应答物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特异性结合（反应原性）物质。抗原免疫原性取决于抗原①异物性；②大分子；③表面积；④专一决定簇等。免疫组化概论抗原抗体第11页免疫原性反应原性完全抗原completeantigen有有半抗原hepten无有半抗原＋载体蛋白全抗原载体蛋白：BSA、多聚赖氨酸、牛甲状腺球蛋白等；（免疫原性强，易取得，交叉反应易去除）交联要求：不改变半抗原分子构型；远离半抗原抗原决定簇；高结合率（结合半抗原数目最少20个以上）交联剂免疫组化概论抗原抗体第12页

抗原决定簇(表位)：抗原分子中决定抗原特异性活性化学基团，其性质、数量、空间构型决定抗原特异性。---免疫组化准确性、特异性

免疫组化概论抗原抗体第13页交叉反应：抗原（或抗体）除与其对应抗体（或抗原）特异结合外，有时可与其它抗体（或抗原）发生反应。---多数天然抗原表面带有多个相同或不一样表位---不一样抗原表位相同或相同情况下可发生交叉反应---免疫组化假阳性免疫组化概论抗原抗体第14页二、抗体B细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞所产生糖蛋白，又称免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。---可与对应抗原特异性结合---亦可作为抗原，激发免疫应答免疫组化概论抗原抗体第15页抗体分子结构

1.抗体分子在立体构型上都是Ig，但Ig不都是抗体。

2.各类Ig基础单位都是四条肽链对称结构,包含二条相同重链(heavychain,H链),及二条相同轻链(lightchain,L链),每条重链(H链)和轻链(L链)分为氨基端(N端)和羧基端(C端)。免疫组化概论抗原抗体第16页

3.两条重链间，两条轻链间及重链和轻链间，分别借二硫键连接。此为免疫球蛋白基础结构，又称为免疫球蛋白单体,呈“Y”字构型。免疫组化概论抗原抗体第17页4.重链上结合有不一样量糖,故Ig属糖蛋白。依据重链抗原性不一样可分为5类，即μ链，γ链，α链，δ链和ε链，由它们组成Ig分别称为IgM，IgG，IgA，IgE和IgD。免疫组化概论抗原抗体第18页

5.轻链也可依据其化学结构和抗原性差异分为κ和λ二型。一个Ig分子二条轻链型别相同，绝无可能κ型和λ型共同存在于同一个Ig分子中。免疫组化概论抗原抗体第19页6.Ig单体氨基酸序列可分为恒定区（constantregion,C区)和可变区（variableregion,V区）。

---可变区位于Ig多肽链N端，占轻链约1/2及重链约1/4（Ig结合抗原所在部位）

---恒定区位于Ig多肽链C端，占轻链余下1/2及重链3/4（补体结合域，Fc受体结合位点，Ig抗原决定簇等所在部位）免疫组化概论抗原抗体第20页7.Ig水解片断可因选取水解酶不一样而异。

采取木瓜蛋白酶(papain)水解Ig时：

---2个相同Fab(fragmentantigenbinding)段，即抗原结合片断

---1个Fc（fragmentcrystalliable)段，即可结晶片断，拥有Ig抗原决定簇。免疫组化概论抗原抗体第21页

采取胃蛋白酶（pepsin），其酶切位点在Ig重链间二硫键近羧基端---一个具双价抗体活性F(ab’)2片断---一个不具任何免疫活性Fc’片断。免疫组化概论抗原抗体第22页8.抗体蛋白类型主要为IgG和IgM。---IgM见于首次免疫和免疫早期，滞留时间较短。---IgG普通见于加强免疫和免疫晚期，滞留时间较长，是免疫球蛋白主要类型。免疫组化概论抗原抗体第23页三、抗体制备依制备路径，当前人工制备特异性抗体有三类：---多克隆抗体（PcAb）---单克隆抗体（McAb）---基因工程抗体免疫组化概论抗原抗体第24页（一）

抗原提取与纯化普通标准1.建立检测方法（定性、定量、活性）2.选择抗原含量高、易取得、价廉、可大量搜集样品为原料---人AFP……AFP(+)肝癌病人腹水；4～6月胎儿血清---鼠AFP……孕18天大鼠羊水---波形蛋白（vimentin）……猪、牛眼晶状体---角蛋白（keratin）……角化上皮---肌红蛋白（myoglobin）……骨骼肌---胶原（collagen）……皮肤、肌腱等免疫组化概论抗原抗体第25页3.保持抗原分子稳定性----低温、适度pH与离子强度、抑制酶解、保护巯基

4.操作步骤简易、有效。---提取---分离纯化---浓缩---贮存免疫组化概论抗原抗体第26页

（二）多克隆抗体（抗血清）PcAb制备程序

多克隆抗体---指由不一样克隆B细胞产生抗体混合物。---每种抗原有多个表位---用其免疫动物会产生针对各表位不一样抗体（多克隆抗体）---血清中抗体皆是多克隆优点：制备简便、价格低廉、抗体效价高缺点：特异性不高、易发交叉反应、效价不太稳定

免疫组化概论抗原抗体第27页

（二）多克隆抗体（抗血清）PcAb制备程序

1．

抗原纯化………免疫原

2．

免疫动物………免疫对象

3．

搜集抗血清……粗、混合品

4．

提取IgG………PcAb，纯品

5．

质量判定……效价、特异性、蛋白量

6．

保留与使用……免疫试剂纯度（杂→纯）：抗血清→r球蛋白→IgG→特异性IgG→IgG片段（Fab或F(ab’)2）抗体≠IgG免疫组化概论抗原抗体第28页

（三）单克隆抗体制备及其应用

单克隆抗体是指由单个克隆杂交瘤细胞产生针对一个抗原决定簇特异性抗体。它是采取B淋巴细胞杂交瘤技术（抗体细胞工程）制备。优点：纯度高、特异性强、交叉反应少、质量和效价稳定缺点：制备复杂、价格昂贵、抗体效价较低免疫组化概论抗原抗体第29页1.利用杂交瘤技术制备McAb基础原理

---淋巴细胞产生抗体克隆选择学说，即一个B细胞克隆只产生一个抗体；

---细胞融合技术产生杂交瘤细胞能够保持双方亲代细胞特征；

---利用代谢缺点补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需McAb。免疫组化概论抗原抗体第30页

2.McAb制备流程亲本细胞准备→细胞杂交融合（PEG）→HAT选择性培养→杂交瘤细胞克隆性培养与建株（有效稀释法）→大量制备单克隆抗体→质量判定与分装冻存

↓（扩充培养或接种动物）（杂交瘤细胞冻存与复苏）免疫组化概论抗原抗体第31页

抗原免疫免疫脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞

(BALB/C小鼠) （经8-AG或6-TG诱导）

(亲本细胞)

混合、融合（PEG） 选择性培养（HAT） 筛选和克隆化冻存 阳性细胞建株（稳