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文档简介
实验13DNA片段的PCR扩增1、用PCR技术对DNA进行扩增2、用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增后的DNA进行检测
1ppt课件.实验13DNA片段的PCR扩增1、用PCR技术对DNA进电泳观察PCR反应
实验步骤2ppt课件.电泳观察PCR反应实验步骤2ppt课件.DNA在体内复制的条件是什么?模板:酶:原料、能量:解旋酶、DNA聚合酶等。DNA分子的每条链dATP、dGTP、dCTP、dTTP引物:温和的反应条件3ppt课件.DNA在体内复制的条件是什么?模板:解旋酶、DNA聚合酶等。DNA分子的结构4ppt课件.DNA分子的结构4ppt课件.合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸5ppt课件.合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸5ppt课件.合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸dATPdGTPdCTPdTTP6ppt课件.合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸dATPdGT
聚合反应机理:7ppt课件.7ppt课件.DNA聚合酶8ppt课件.DNA聚合酶8ppt课件.不同细胞的细胞周期
不同生物细胞
需要的时间细菌一般是20~30分钟蚕豆根尖细胞17.3小时小鼠十二指肠细胞15.3小时人的肝细胞22小时人的宫颈癌细胞22.5小时PCR技术可在几小时内,将特定核酸序列扩增百万倍!9ppt课件.不同细胞的细胞周期不同生物细胞需要的时间细PCR的概念
PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)是指在体外,通过特异DNA引物扩增核酸分子中某个特定区域的技术。10ppt课件.PCR的概念PCR10ppt课件.
PCR的反应体系DNA模板原料:
dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP);酶:Taq聚合酶(嗜热细菌中分离得到)引物:(单链DNA片段)Mg2+(维持酶活性所必需)PCR缓冲液:维持pH,保护Taq酶
11ppt课件.11ppt课件.PCR技术原理变性退火延伸12ppt课件.PCR技术原理变性退火延伸12ppt课件.PCR三步曲
预变性保温变性90~95℃延伸70~75℃退火40~60℃13ppt课件.PCR三步曲预变性保温变性90~95℃延伸70~75PCR仪14ppt课件.PCR仪14ppt课件.用于PCR的预混液(500
L体系):
ddH2O310
L10×butter50
LMgCl240
LdNTP混合液20L引物125L引物225L模板DNA25L
TaqDNA聚合酶5L
标记一个微量离心管,用取样器取20
L的预混液加入到该管中。15ppt课件.用于PCR的预混液(500L体系):标记反应试剂
用量PCRSuperMix10μL引物Ⅰ(浓度10μM)1μL引物Ⅱ(浓度10μM)1μL模板DNA5μLddH2O3μL总体积20μL16ppt课件.反应试剂微量可调移液器(一档吸、二档排)17ppt课件.微量可调移液器(一档吸、二档排)17ppt课件.PCR反应参数:
变性94℃30s退火52℃30s延伸72℃60s
预变性94℃300s
保温72℃600s循环次数3518ppt课件.变性94℃30s退火1、基本概念以琼脂糖凝胶作为介质,DNA在外加电场的作用下泳动的技术。2、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳19ppt课件.1、基本概念琼脂糖凝胶电泳19ppt课件.琼脂糖凝胶电泳基本原理20ppt课件.琼脂糖凝胶电泳基本原理20ppt课件.21ppt课件.21ppt课件.制胶使用电泳缓冲液在制胶器上配制1.0%的琼脂糖凝胶。混样2μL载样缓冲液、2μL核酸荧光染料,10μLPCR产物混匀。点样将上步混好的样10μL加到凝胶孔中。电泳90V电压下电泳10~20min。琼脂糖凝胶电泳的过程22ppt课件.制胶使用电泳缓冲液在制胶器上配制1.0%的琼脂糖凝胶。混样2将凝胶倒入制胶器的槽中(60oC)将琼脂糖加入电泳缓冲液,在微波炉中加热溶解至透明。制胶23ppt课件.将凝胶倒入制胶器的槽中将琼脂糖加入电泳缓冲液,制将梳子从制胶槽中拔出
24ppt课件.将梳子从制胶槽中拔出24ppt课件.取出凝胶板放入电泳槽中
向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶
25ppt课件.取出凝胶板放入电泳槽中向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶
琼脂糖凝胶电泳中缓冲液的作用1、增加电导率;2、维持电泳过程中的合适的pH。26ppt课件.琼脂糖凝胶电泳中缓冲液的作用26ppt课件.吸取PCR反应产物10µL。注意吸头要插入到管底,才能取到PCR产物。
将PCR产物与加样缓冲液充分混合(吸排几次)
混样27ppt课件.吸取PCR反应产物10µL。注意吸头要插入到管底,才能取到P常用的上样缓冲液配方及各成分的作用蔗糖使样品呈色,便于上样,形成可见指示带,预测电泳进程。溴酚蓝增加样品密度,保证DNA均匀沉入加样孔内。核酸荧光染料可嵌合入DNA分子,在特定激发光源的激发下可发出荧光,荧光强度与DNA含量成正比。(需要与加样缓冲液混合)28ppt课件.常用的上样缓冲液配方及各成分的作用蔗糖溴酚蓝增加样品密度,保加样29ppt课件.加样29ppt课件.进行电泳10-20分钟电泳30ppt课件.进行电泳10-20分钟电泳30ppt课件.实验用的核酸荧光染料与DNA嵌合后,在DNA图谱观察仪的可见光下发射黄绿色荧光。电泳结果的观察在DNA电泳图谱观察仪中观察核酸条带并拍照。31ppt课件.实验用的核酸荧光染料与DNA嵌合后,在DNA
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