分子生物学分子杂交技术课件

分子杂交及生物芯片技术申川军广州中医药大学生物化学教研室分子杂交及生物芯片技术申川军参考书屈伸刘志国参考书屈伸刘志国2目录

第一章生物大分子制备和分析常用技术

第二章蛋白质、核酸的提取与分离

第三章PCR技术

第四章分子杂交与印迹技术

第五章分子克隆技术

第六章外源基因转移技术

第七章蛋白质表达技术

第八章分子标技术

第九章分子改造技术

第十章测序及人工合成技术

第十一章基因组学技术

第十二章蛋白质组学技术

第十三章生物芯片技术

第十四章生物信息学技术

目录

3参考书马文丽

郑文岭

彭翼飞

参考书马文丽

郑文岭

彭翼飞

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目录第一章核酸的分子结构与分子杂交的基本原理第二章核酸分子杂交的类型第一节固相核酸分子杂交类型一、菌落原位杂交（colonyinsituhybridization）二、斑点杂交（dotblot）三、southern印迹杂交（southernblot）四、northern印迹杂交（northernblot）五、组织原位杂交（tissueinsituhybridization）第三章核酸探针的种类、标记及检测第一节核酸探针的种类dna探针cdna探针rna探针寡核苷酸探针第二节核酸探针的标记和检测放射性同位素非放射性核酸探针第四章核酸分子杂交实验因素的优化探针选择标记方法浓度杂交率杂交最适温度杂交的严格性反应时间杂交促进剂第五章斑点杂交

5第六章southern印迹杂交第一节southern印迹杂交的基本原理一、dna从凝胶到膜上的转移方法二、southern杂交膜三、核酸探针的标记第二节southern印迹法的基本过程一、dna样品的酶切和电泳二、准备用于转移的凝胶三、dna从琼脂糖凝胶转移到固相支持物四、探针标记五、杂交六、洗膜七、杂交结果的检测八、杂交膜的重复使用九、注意事项十、杂交严谨性第七章northern印迹杂交第八章原位杂交第九章菌落原位杂交第十章dna芯片技术第六章southern印迹杂交6基本概念变性/复性：分子杂交：异源互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子的过程称为分子杂交。分子杂交技术：凝胶电泳分离待测DNA、RNA、Pr并转移固定到支持物或结合物上，然后与探针/抗体杂交分析。探针(Probe)：已知序列的标记单链核酸片断，用于检测与其互补的待测核酸。基本概念变性/复性：7BasepairingoccursinduplexDNAandalsoinintra-andinter-molecularinteractionsinsingle-strandedRNA(orDNA).Basepairingoccursinduplex8基本概念原位杂交（Insituhybridization,ISH）：菌落原位杂交(ColonyISH)组织原位杂交(TissueISH)：胚胎原位杂交(EmbryoISH)：斑点/狭缝杂交(Dot/slotblot)：基本概念原位杂交（Insituhybridization9基本概念Bio-chip（生物芯片）DNAchip/microarrayGenechip/microarrayOligonucleotidemicroarraycDNAchipProteinchipmicroRNAchipLab-on-chip（芯片实验室）基本概念Bio-chip（生物芯片）10分子生物学分子杂交技术课件11分子生物学分子杂交技术课件12分子杂交技术生物大分子的印迹杂交技术分子杂交技术生物大分子的印迹杂交技术分子杂交技术定义：凝胶电泳分离待测DNA、RNA、Pr并转移固定到结合物上，然后与探针/抗体杂交分析原理：核酸变复性（序列互补）/抗原-抗体基本工艺：凝胶电泳（原位处理）样品转移及固定杂交分析（免疫结合分析）分子杂交技术定义：凝胶电泳分离待测DNA、RNA、Pr并转移14分子杂交技术1969，Insituhybridization（ISH）1975，Southern，Southernblot:DNA1977，Alwine，Northernblot：RNA1979，Towbin，Westernblot：Pr1982，Reinher，Easternblot：Pr(IEF)分子杂交技术1969，Insituhybridizat15分子杂交技术探针探针基本条件（特点）标记物（32p,35S,125I,Digoxigenin,FITC）单链核酸（ssDNA，sscDNA(更常用)）高特异性（~500bp）标记物稳定灵敏，检测方便安全分子杂交技术探针探针基本条件（特点）16分子杂交技术探针探针的种类DNAprobe（基因copy数、病原基因诊断）cDNAprobe（基因表达等最常用）RNAprobe（ISH）Oligonuleotide-probe（25~50bp；基因诊断，SNP分析、测序、点突变检测）分子杂交技术探针探针的种类17分子杂交技术探针探针标记物放射性标记物（[α-*N]-dNTP）32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d)非放射性标记物半抗原：生物素、地高辛荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）分子杂交技术探针探针标记物18分子杂交技术探针-32P-dNTP结构A、G、C或TNHHPP32POOOOOOHOHOHHOOOHHHHOCH2分子杂交技术探针-32P-dNTP结构A、G、19分子杂交技术探针分子杂交技术探针20分子杂交技术探针探针标记随机引物法缺口平移法(DNaseIandDNA聚合酶I)末端标记法碱性磷酸酶-T4多核苷酸激酶[γ-32p]-ATP标记DNA/RNA-5′末端转移酶（poly(N*)n）T4DNA聚合酶/Klenow片断（粘末端补平）分子杂交技术探针探针标记21分子杂交技术探针探针纯化乙醇沉淀法凝胶过滤法（G-50Spincolumn）分子杂交技术探针探针纯化22分子杂交技术—印迹印迹（转膜）支持物：硝酸纤维素膜（NC膜）尼龙膜N+-nylon（DNA/RNA）中性膜PVDF膜（westernblot）分子杂交技术—印迹印迹（转膜）支持物：23分子杂交技术—印迹印迹（转膜）方法：毛细管虹吸转移法真空转移法电转移法分子杂交技术—印迹印迹（转膜）方法：24分子杂交技术—印迹湿滤纸缓冲液滤纸桥凝胶硝酸纤维素膜吸水纸玻璃板支持台容器重物毛细管虹吸转移法分子杂交技术—印迹湿滤纸缓冲液滤纸桥凝胶硝酸纤吸水纸玻璃板支25分子杂交技术—印迹尼龙膜凝胶滤纸海绵凝胶支持夹缓冲液电极+–滤纸电极电转移法分子杂交技术—印迹尼龙膜凝胶滤纸海绵凝胶支持夹缓冲液电极+–26分子杂交技术—印迹真空转移法-1h分子杂交技术—印迹真空转移法-1h27分子杂交技术—印迹真空转移装置分子杂交技术—印迹真空转移装置28分子杂交技术—印迹Westernblot(SDS及转膜系统)分子杂交技术—印迹Westernblot(SDS-PAG29分子杂交技术—影响因素离子强度(高-消除静电斥力-利于杂交)温度（低于Tm20-25℃）有机试剂（去离子甲酰胺）-降低Tm样品/探针分子的大小和复杂程度洗涤条件（高严谨性，洗去非特异性结合探针）支持物添加物（吸附DNA探针，使DNA接触面增大）分子杂交技术—影响因素离子强度(高-消除静电斥力-利于杂交)30#预杂交

为减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，杂交前用封闭物将这些非特异位点封闭。变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。#预杂交为减少探针与广泛存在的非互补31分子杂交技术—基本流程样品及探针制备样品电泳分离转膜预杂交杂交洗膜分析（压片、显色、荧光观察等）分子杂交技术—基本流程样品及探针制备32分子杂交技术SouthernblotDNA提取酶切电泳/拍照转膜/固定探针制备预杂交杂交洗膜扫磷屏分子杂交技术Southernblot33分子杂交技术UV交联仪多用途254nm紫外辐射系统，主要用于将核酸交联于膜上。还用于琼脂凝胶中DNA的切割，RecA突变筛选，胸腺二聚体产生的部分限制性内切酶消化，UV灭菌消除PCR污染。另紫外灭菌-聚合物紫外处理。分子杂交技术UV交联仪多用途254nm紫34分子杂交技术Southernblot应用DNA多态性分析（RFLP分析/SNP/SSCP/RAPD）基因突变检测基因copy数检测重组子筛选DNA指纹分析测序分子杂交技术Southernblot应用35分子杂交技术Southernblot应用DNA指纹分析血迹中的DNA分子杂交技术Southernblot应用血迹中的DNA36分子杂交技术Northernblot基因表达分析mRNA长度及半定量分析RNA分子（TRIzol）甲醛变性电泳至膜上转膜杂交、显影凝胶滤膜用10xSSC转移RNA吸附有RNA片段的膜（亚甲蓝染色）带有RNA片段的凝胶分子杂交技术NorthernblotRNA分子（TRIz37分子杂交技术Westernblot蛋白提取/样品准备SDS电转/丽春红S染色封闭一抗孵育洗涤一抗二抗孵育洗膜结果观察/显色（Dig-AP/FITC）组织蛋白分子杂交技术Westernblot组织蛋白38分子杂交技术ISH胚胎/组织制备固定消化/再固定/洗涤RNA探针制备封闭杂交/洗涤一抗/洗涤二抗/洗涤显色(Dig-、FITC、Cy5)抗衰老基因Klotho原位杂交图斑马鱼krox20基因原位杂交图3,5菱脑节分子杂交技术ISH抗衰老基因Klotho原位杂交图斑马鱼k39分子杂交技术FISH分子杂交技术FISH40生物芯片Biochip生物芯片Biochip生物芯片定义：在斑点杂交基础上，模拟制备大规模集成电路的基本原理，集成了探针原位合成、照明平板印刷、精密控制、激光共聚焦显微技术发展来的一门分子生物学技术原理：将大量样本固定于较小的支持物上，然后与标记好的待测样品杂交，再检测杂交信号的强弱，从而判断样本中待测DNA、RNA、Pr等分子数量或活性状态特点：高通量、微型化、集约化、标准化等生物芯片定义：在斑点杂交基础上，模拟制备大规模集成电路的基本42生物芯片生物芯片43生物芯片种类微阵列芯片（基因芯片/蛋白芯片/细胞芯片等）微流控芯片（属于主动式芯片，如样品制备芯片、PCR芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片等）芯片实验室（以生物芯片为基础的集成化分析系统;可完成如样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作）生物芯片种类44生物芯片基本流程：芯片制备原位合成法原位光照蚀刻微量点样法样品制备（Sample-Cy3；Control-Cy5）分子杂交检测分析（Confocus、CCD）生物芯片基本流程：45生物芯片原位光照蚀刻原理石英片氢化后封闭设计11um见方窗口遮罩对封闭部分光解将nt加入通过化学偶合连接到晶片上更换不同的遮罩进行UV光解加入nt进