第6章-现代生物技术与污染治理-课件

第六章现代生物技术与环境污染治理第一节现代生物技术概况一、现代生物技术概述■生物技术（biotechnology）是指人们以现代生物科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。1ppt课件(一)生物技术的内容■现代生物技术主要包括基因工程酶工程细胞工程发酵工程■基因工程技术是核心技术，它能带动其他技术的发展，如通过基因工程对细菌或细胞改造后获得的工程菌或细胞，必须通过发酵工程或细胞工程来生产有用物质。2ppt课件（二）生物技术的种类及其相互关系1.种类（1）基因工程Geneengineering■应用人工方法将生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组。■将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变他们的遗传品性或获得基因产物。3ppt课件（2）细胞工程cellengineering■以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动植物个体，或获得某种有用的物质的过程。■包括：动植物细胞的体外培养技术细胞融合技术细胞器移植技术等。4ppt课件（3）酶工程Enzymeengineering■利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助于生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。■包括：酶的固定化技术细胞的固定化技术酶的修饰改造技术酶反应器的设计技术5ppt课件（4）发酵工程

Fermentationengineering■利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，在合适条件下，通过现代化工程技术手段，由微生物的某种特定功能生产出人类所需的产品的过程。6ppt课件（5）蛋白质工程

Proteinengineering■在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要的新型蛋白质。7ppt课件2.相互关系8ppt课件现代生物技术涉及的学科生物化学分子生物学微生物学遗传学细胞生物学化学工程农业生物技术医药生物技术生物技术疫苗生物技术诊断家畜生物技术海洋生物技术环境生物技术现代生物技术9ppt课件生物技术树形图10ppt课件（三）生物技术的基本特征■高效益可带来高额利润■高智力具有创造性和突破性■高竞争时效性的竞争非常激烈■高投入前期研究及开发需要大量资金投入■高风险竞争的激烈，必然带来高风险■高势能对国家的政治、经济和文化及社会发展有很大的影响，具有很高的态势和潜在的能量11ppt课件（四）生物技术所涉及的行业种类疾病治疗用于控制人类疾病诊断临床检测，食品、环境检测农林与园艺新型农作物、动物食品扩大食品、饮料的来源环境废物处理、生物净化化学品酶、核酸类及特殊化学品设备生物技术所需的设备12ppt课件二、环境生物技术1.一般概念■应用于认识和解决环境问题过程的生物技术体系，包括对环境污染效应的认识、环境质量评价和环境污染的生物处理技术等。（教材）13ppt课件■直接或间接利用生物或生物体的某些组成成分或某些机能，建立降低或消除污染物产生的工艺过程，或者能够高效净化环境污染，同时又生产有用物质的工程技术。清华《现代环境生物技术》2.广义概念■凡是自然界中涉及环境污染控制的一切与生物技术有关的技术。14ppt课件■德国生物技术中心Timmis博士认为(1)在环境中应用的生物技术，这是相对于一些高度控制条件下的密闭反应器中进行的生物技术而言。(2)涉及到环境中某些可以看作为一个生物反应器部分的生物技术。(3)作用于一些必定要进入环境的材料的生物技术。■美国密歇根州立大学的Tiedje教授认为，环境生物技术的核心是微生物学过程。15ppt课件3.环境生物技术可分为3个层次■高层次：以基因工程为主导的现代污染防治生物技术，如基因工程菌的构建、抗污染物转基因植物的培育等；■中层次：指传统的生物处理技术，如活性污泥法、生物膜法，及其在新的理论和技术背景下产生的强化处理技术和工艺，如生物流化床、生物强化工艺等；■低层次：利用天然处理系统进行废物处理的技术，如氧化塘、人工湿地系统等。■三种层次均是污染治理不可缺少的生物技术手段。16ppt课件4.环境生物技术研究范围■解决基因工程菌从实验室进入模拟系统和现场应用过程中，其遗传稳定性、功能高效性和生态安全性等方面的问题；■开发废物资源化和能源化技术，利用废物生产单细胞蛋白、生物塑料、生物肥料以及利用废物生产生物能源，如甲烷、氢气、乙醇等；■建立无害化清洁生产新工艺，如生物制浆、生物絮凝剂、煤的生物脱硫、生物冶金等；■发展对环境污染物的生理毒性及其对生态环境影响的检测技术。17ppt课件第二节基因工程与环境污染生物治理一、基因工程的分子生物学基础1.核酸的结构与功能核酸是一类由各种核苷酸聚合而成的生物大分子。(1)核酸分类

脱氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（RNA）18ppt课件核苷酸结构(1)

碱基—糖之间是β—糖苷键(2)糖—磷酸之间是磷酸酯键19ppt课件（2）DNA结构A、两条反向平行的核苷酸链共同盘绕形成双螺旋，糖－磷酸－糖构成螺旋主链B、两条链的碱基都位于中间，碱基平面与螺旋轴垂直。C、两条链对应碱基呈配对关系

A＝TG≡CD、螺旋直径2nm，螺距3.4nm，每一螺距中含10bp20ppt课件21ppt课件（3）DNA的复制DNA复制特点：■从特定的位点开始■半保留复制■具有高保真性■多种酶和蛋白因子共同作用的结果22ppt课件（4）DNA的变性、复性与杂交■变性在加热或某些试剂的作用下，DNA配对碱基之间的氢键结构受到破坏，双链DNA的多核苷酸链能完全分离，分离过程称为变性（denaturation）或熔解（melting）。■复性变性DNA在一定条件下能恢复其双螺旋结构，这个过程叫DNA复性（renaturation）。■杂交当复性的DNA分子由不同的两条单链分子形成时，称为杂交（hybridization）。23ppt课件DNA的变性与复性24ppt课件（5）核酸的功能■贮藏遗传信息的功能■传递遗传信息的功能■表达遗传信息的功能Crick提出中心法则■确定遗传信息由DNA通过RNA流向蛋白质的普遍规律。25ppt课件遗传信息的传递方向——中心法则DNA通过以自身为模板进行复制而使遗传信息代代相传，并通过RNA最终将遗传信息传给蛋白质分子。遗传信息储存在核酸中遗传信息由核酸流向蛋白质26ppt课件RNA的转录（1）以DNA为模板，在RNA聚合酶的催化下合成RNA的过程称为转录。（2）转录是基因表达的关键一步，DNA分子中所储存的遗传信息，必须转录成信使RNA（mRNA）才能通过蛋白质生物合成的过程变成具有生物活性的蛋白质。27ppt课件翻译——蛋白质的生物合成■以RNA为模板合成蛋白质的过程叫翻译。■通过转录将储存在DNA分子中的遗传信息传递给为蛋白质编码的mRNA，翻译就是将以核苷酸形式编码在mRNA中的信息转变成多肽链中特定的氨基酸顺序。■翻译过程是一个很复杂的生物反应过程，需要大约二百多种以上的生物大分子，其中包括核糖体、mRNA、tRNA、氨酰tRNA合成酶、各种可溶性的蛋白因子等参加并协同进行。28ppt课件真核生物蛋白质合成过程中外显子和内含子的关系蛋白质mRNAmRNA前体DNA

外显子1内含子1外显子2内含子2外显子3内含子3外显子4剪接翻译29ppt课件原核生物的操纵子模型■1961年F.Jacob和J.Monod通过不同的大肠杆菌乳糖代谢突变体的研究，提出了操纵子模型学说（operontheory）。■生物活性相关基因组织在一起进行统一的调控，并保持各基因产物的精确比例。30ppt课件乳糖操纵子31ppt课件32ppt课件真核生物基因结构33ppt课件什么是基因？■根据目前人们的认识，基因应该是能够表达和产生基因产物的DNA（RNA）序列。■根据产物类别分为：Protein基因、RNA基因（tRNA基因和rRNA基因）两大类。■根据产物功能分为：结构基因（酶和不直接影响其他基因表达的蛋白质）和调节基因（阻遏蛋白或转录激活因子）。■概括起来基因就是一段含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。34ppt课件二、基因工程的基本过程■带有目的基因的DNA片段的获取■在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到载体上，形成重组DNA分子■重组DNA分子导入受体细胞（也称宿主细胞或寄主细胞）■带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体剪、接、转、筛第二节基因工程与环境污染生物治理35ppt课件基因工程实验的一般步骤36ppt课件1973年Cohen和Boyer开展的基因重组示意图37ppt课件基因工程的四大要素■工具酶（限制性内切酶、聚合酶、连接酶等）■载体（类型、性质、用途）■目的基因（获取基因的方法）■受体细胞（大肠杆菌细胞、酵母细胞、动植物细胞）38ppt课件三、工具酶常用的工具酶工具酶名称 主要功能 限制性核酸内切酶在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割

DNA连接酶将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键

连接成一个整体

DNA聚合酶I

通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单

链裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切

酶活性 多核苷酸激酶催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5’－OH末端上

反转录酶以RNA或DNA链为模板合成互补的cDNA链

DNA末端转移酶将寡聚物尾巴加到了线性双链或单链DNA分子的

3’－OH末端或DNA的3’－末端标dNTP

第二节基因工程与环境污染生物治理39ppt课件常用的工具酶

(续上表格)工具酶名称 主要功能 碱性磷酸酶去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团

核酸外切酶III降解DNA3’－OH末端的核苷酸残基

降解酶S1降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或

寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链核酸酶Bal31降解双链DNA,RNA的5’及3’末端

TaqDNA聚合酶

能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，

从5’→3’方向合成新生的互补链 核糖核酸酶专一性降解RNA

脱氧核糖核酸酶

内切核酸酶，水解单链或双链DNA

40ppt课件1.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)■细菌的限制-修饰系统（R-MSystem）■限制性核酸内切酶类型■II型限制性核酸内切酶性质和作用特点41ppt课件（1）细菌的限制-修饰系统（R-MSystem）■1965年，Arber等提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(Restriction-modificationsystem)。■甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A成为N6

甲基-腺膘呤，胞嘧啶C成为5’甲基胞嘧啶。■R-M系统是细菌安内御外的积极措施。42ppt课件嘧啶Py

嘌呤Pu甲基化位置43ppt课件由宿主控制的限制与修饰作用由甲基转移酶和限制性核酸内切酶两种酶活性配合进行的

5’GAATTC3’3’CTTAAG5’

EcoRIMEcoRI

限制作用

修饰作用G3’5’AATTC3’5’GAATTC3’CTTAA5’3’G5’3’CTTAAG5’+EcoRIEcoRI与MEcoRI的限制与修饰作用机理44ppt课件（2）限制性核酸内切酶类型ⅡⅠⅢ酶分子内切酶与甲基化酶

分子不在一起三亚基双功能酶(R，M，S亚基)二亚基双功能酶识别位点4-6bp,大多数为回文对称结构非对称5-7bp非对称切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外1000bp在识别位点下游24-26bp限制反应与甲基化反应分开的反应互斥同时竞争限制作用是否需用ATPNoYesYes45ppt课件（3）II型限制性内切酶性质和作用特点■限制酶：同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成。■修饰酶：单体■识别回文对称序列（palindromesequence），在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3‘-羟基和5’-磷酸基团的DNA产物，需Mg2+

，相应的修饰酶只需SAM。■识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列。特点：识别序列和切割位点的双特异性46ppt课件限制酶产生的末端：匹配粘端（matchedend）和平末端（Bluntend）EcoRⅠG▼AATTCHindⅢA▼AGCTTCTTAA▼GTTCGA▼ASmaICCC▼GGGEcoRVGAT▼ATCGGG▼CCCCTA▼TAGHha

IGCG▼CSacIGAGCT▼CC▼GCGC▼TCGAG47ppt课件2.DNA聚合酶（DNApolymerase）■聚合酶类：大肠杆菌DNA聚合酶I大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow酶

T4DNA聚合酶

T7DNA聚合酶

修饰的T7DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶

反转录酶■作用：在DNA模板链上将dNMP连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化合成以模板互补的DNA序列。■共同特点：具有催化核苷酸聚合能力，但在外切酶活性，聚合速率等方面各有差别。48ppt课件大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

（E.coliDNApolymeraseⅠ）①5’→3’DNA聚合酶活性反应底物为单链DNA及引物（带3‘-OH基）或5’突出的双链DNA。

Mg++,

dNTP

DNA聚合酶Ⅰ

49ppt课件②5'→3'外切核酸酶活性■反应底物是双链DNA或DNA:RNA杂交体，它可从5‘端降解双链DNA，也降解RNA:DNA中的RNA（RNaseH活性）。

Mg++,dNTP

DNA聚合酶Ⅰ

50ppt课件51ppt课件③3'→5'外切酶活性■反应底物是带3‘-OH的双链DNA或单链DNA，其活性从3’-OH端降解DNA，可被5‘--3’聚合活性封闭，也可被带5‘磷酸的dNMP所抑制。

Mg++

Mg++,dNTP

DNA聚合酶Ⅰ

DNA聚合酶Ⅰ

■3’-5’外切酶活性与

DNA聚合酶的校正功能有关。52ppt课件E.coliDNA聚合酶Ⅰ的用途①利用

E.coliDNA聚合酶Ⅰ的5‘--3’外切核酸酶活性，可用切口平移法（nicktranslation）标记DNA。53ppt课件②对3'突出端的DNA作末端标记（交换或置换反应），但是此反应用T4或T7DNA聚合酶效果会更好。

54ppt课件3.连接酶（ligase）DNA连接酶的基本反应特性催化双链DNA切口处的5'-磷酸和3'-羟基生成磷酸二酯键连接反应需要供给能量大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源55ppt课件DNA连接酶的作用机理56ppt课件T4DNAligaseE.coliDNAligase来源T4

噬菌体大肠杆菌分子量68,00075,000辅助因子ATPNAD+底物1.双链DNA分子的粘,平端2.RNA-DNA杂和体,RNA链切口3.双链DNA中的单链切口同源互补粘端双链分子中的单链切口应用范围广泛，效率高窄57ppt课件4.其他工具酶T4多核苷酸激酶：

催化－磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA分子的5’－OH末端。碱性磷酸酶：催化除去DNA或RNA5′磷酸的反应。Sl

核酸酶：可降解单链DNA或RNA，是一种单链核酸酶。………

58ppt课件四、载体（Vector）■克隆载体(CloningVector):质粒载体、λ噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体■表达载体（Expressionvector）■穿梭载体(Shuttlevector)■大容量克隆载体：YAC、BAC、PAC第二节基因工程与环境污染生物治理59ppt课件载体的定义和作用■定义:

将外源DNA或基因携带入宿主细胞(hostcell)的工具.通过体外DNA重组方式，可以把基因与载体相连，转移到适当的受体细胞中，进行无性繁殖，从而获得大量的基因片段或相应的蛋白质产物。细菌的质粒、酵母的质粒、噬菌体、病毒DNA的衍生物等，经过改造都可以成为载体。60ppt课件1.质粒（Plasmid）载体(1)质粒的基本特性■质粒是细菌染色体外，能自主复制的双链闭合环状DNA分子。■质粒DNA具有3种不同的构型1)闭合环状DNA,ccDNA,SC构型2)开环DNA,ocDNA,OC构型3)线形DNA,lDNA,L构型61ppt课件62ppt课件性质一:质粒的复制（replication）

■复制起始区■复制子（replicon）从一个复制起点开始所复制的DNA分子或DNA片段是一个基本单位。■在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。■在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制起始位点。■originofreplication，ori

63ppt课件性质二:质粒的拷贝数质粒不同，在宿主细胞中的拷贝数也不同，椐此，将质粒分为两类。■严紧型质粒：其复制受宿主染色体DNA复制的严格控制，每个细胞的拷贝数为几个。

pSC101■松弛型质粒：其复制是在松弛控制下进行的；每个细胞的拷贝数10-200个。

pMB1（或ColE1）64ppt课件性质三:质粒的不相容性两种不同质粒不能共存于同一宿主细胞内的现象称为质粒的不相容性。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。65ppt课件性质四:质粒的转移性在自然条件下，很多质粒可以通过细菌接合的作用转移到新宿主内。质粒需要携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因.如移动基因mob

，转移基因tra

，顺式因子bom

及其内部的转移切口位点nic。基因工程中使用的是非接合型质粒，因缺乏转移所必需的mob基因，不能发生自我迁移。66ppt课件67ppt课件(2)标记基因■选择标记:用于鉴别目标DNA（载体）的存在，将挑选转化了载体的宿主。主要为抗生素抗性基因。■筛选标记:用于将特殊表型的重组子挑选出来，主要标记为α-互补和插入失活。四、载体（Vector）

1.质粒载体68ppt课件常见的选择标记①

氨苄青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene,ampr）Ampr氨苄青霉素可抑制细胞壁肽聚糖合成、抑制细菌转肽反应。氨苄青霉素抗性基因编码1个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，催化β-内酰胺环水解，解除氨苄青霉素的毒性。②卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycinresistancegene,kanr,neor）KanrNeor卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。抗性基因是编码氨基糖苷磷酸转移酶，可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。69ppt课件③四环素抗性基因（Tetracyclineresistancegene,tetr）Tetr四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。④氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene,Cmr,cat）氯霉素与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。cat编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白。在乙酰辅酶A存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。70ppt课件筛选标记重组质粒的筛选

α-互补（α-complementation）指lacZ

基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β-alactosidase，由1024个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。71ppt课件大肠杆菌的乳糖lac操纵子中的lacZ

基因编码β-半乳糖苷酶。lacZ△M15基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第11-41个氨基酸的lacZ

基因，无酶学活性。只编码N-端140个氨基酸的lacZ

基因（称为lacZ′)，其产物也没有酶学活性。这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。△：deletion

LacZ△M15和lacZ′

72ppt课件lacZ

和lac

Z’多肽的结构关系（左）

和通过α-互补产生的菌落颜色变化（右）lacZ’lacZFlacZ△M15lacZ’lacZ‘lacZ△M15140个氨基酸140个氨基酸＋MCSlacZ’编码缺失第11-41位氨基酸IPTG／X-galIPTG／X-gallacZ△M15lacZ’ΩDNAlacZ△M15lacZ’蓝色白色73ppt课件乳糖既是lac操纵子的诱导物，也是作用的底物。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作为lac

操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物.5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）可作为lac

操纵子的底物，但不能作为诱导物。底物X-gal还可充作生色剂，被β-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。重组质粒，因互补作用遭到破坏，将显示白色菌落。IPTG和X-gal的作用

74ppt课件蓝白斑图示请记住：什么是α-互补作用？IPTG？X-gal？75ppt课件结构来源oriAmprTetr①pBR322质粒载体

（3）重要的大肠杆菌质粒载体

1.质粒载体四、载体（Vector）

1.质粒载体76ppt课件pBR322质粒图谱77ppt课件插入失活78ppt课件②pUC18和pUC19

pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5′-端带有一段多克隆位点的lacZ′基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

多克隆位点：MCSMultiplecolningsite1.质粒载体四、载体（Vector）

1.质粒载体79ppt课件典型的pUC系列的质粒载体，包括以下组成部分：（i）来自pBR322质粒的复制起点（ori）（ii）氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点（iii）大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，即lacZ′基因（iv）位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。

80ppt课件pUC18/19质粒图谱

81ppt课件pUC18/19质粒MCS图谱82ppt课件③pUC118和pUC119由pUC18/19增加了一些功能片段改造而来，大小为3162bp。相当于在pUC18/19中增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。噬菌粒phagemide1.质粒载体四、载体（Vector）

1.质粒载体83ppt课件pUC118/119质粒图谱84ppt课件2.大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体的结构大肠杆菌表达载体都是质粒载体。表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。基本骨架是最简单的质粒克隆载体中的复制起点和氨苄青霉素抗性基因，相当于pUC类的载体。在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。四、载体（Vector）

2.大肠杆菌表达载体85ppt课件（1）表达元件①启动子

转录是由RNA聚合酶在启动子部位启动RNA转录的过程。当转录启动以后，RNA聚合酶对启动子下游要转录的序列是无法识别的，这就为利用强启动子来表达目的基因提供了可能。主要3类启动子：乳糖操纵子lac基因的启动子及其与色氨酸合成操纵子中trp启动子拼接形成的杂合启动子tac或trc，所有这些启动子都受IPTG诱导；T7噬菌体启动子；噬菌体的PL启动子。86ppt课件②终止子转录会受到模板RNA序列结构的影响，当遇到颈环结构时转录便会停止，或遇到ρ因子介导的终止信号转录也会停止。③核糖体结合位点

转录出来的mRNA可在宿主细胞的翻译机器作用下翻译出目的蛋白。细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效的核糖体结合位点以及其中的Shine-Dalgarno序列（SD序列），从而启动邻近其下游的翻译起始密码子的蛋白质翻译。（表示方法：RBS,rbs，DNAormRNA上)87ppt课件16SrRNA16SrRNAUCCUCCAAGGAGGU5’mRNAGAUUCCUUUGACCU--AUG-CGA-GCU-UUU-AGUf--Met--Arg--AlaPheSer–S-D序列与16SrRNA结合示意图88ppt课件89ppt课件（2）利用T7噬菌体启动子的表达载体pET载体及其表达系统pET-5a：在载体的基本结构上加入了T7噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。T7噬菌体启动子：只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别并启动转录，而大肠杆菌的RNA聚合酶不能作用于T7噬菌体启动子。用于表达的宿主细胞必须能表达T7噬菌体的RNA聚合酶。常用的pET表达载体的宿主菌：大肠杆菌BL21（DE3）四、载体（Vector）

2.大肠杆菌表达载体90ppt课件大肠杆菌表达载体pET-5a图谱91ppt课件T7tag:T7基因10蛋白的氨基末端11aa92ppt课件控制外源基因严谨表达的2个系统通过宿主控制T7RNA聚合酶的量来实现的，即在宿主细胞中引入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的质粒，如pLysS或pLysE，它们分别低量和高量表达T7噬菌体的溶菌酶。该溶菌酶可抑制T7RNA聚合酶的活性，从而减少在未诱导情况下外源基因表达。使启动子的控制效应更严谨。在pET载体上装载lacⅠ基因，提高阻抑物的浓度。也可利用T7-lac启动子（在T7启动子序列下游装入一个由25bp组成的lacO操纵子序列），当阻抑物结合在lacO位点时，即使存在T7RNA聚合酶，外源基因也无法表达。只有当诱导物存在时，才能解开T7RNA聚合酶基因和外源基因表达的双重阻遏。93ppt课件大肠杆菌中T7启动子表达调控模式图94ppt课件（3）表达融合蛋白的表达载体通过融合蛋白的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质，可对目的蛋白进行分离和纯化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag）常用标签：谷胱甘肽S转移酶（glutathioneS-transferase,GST）、六聚组氨酸肽（polyHis-6）、蛋白质A（proteinA）等。四、载体（Vector）

2.大肠杆菌表达载体95ppt课件融合蛋白的剪切点

启动子标签蛋白目的蛋白终止子96ppt课件①GST融合表达载体GST表达载体：pGEX载体系列。pGEX-4T-1，在启动子tac和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列，（A）谷胱甘肽-S转移酶基因(B)凝血蛋白酶（thrombin）切割位点的编码序列。当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。GST是来源于血吸虫的小分子酶（26kDa），在E.coli易表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有很强的结合能力。利用这些性质可用来分离纯化表达的目的蛋白。97ppt课件图5-4GST融合表达载体pGEX图谱98ppt课件分离纯化表达的目的蛋白吸附：将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时，融合蛋白将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗脱出来。洗脱：含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱，可将融合蛋白释放出来。酶切：用凝血蛋白酶切割融合蛋白，获得纯化的目的蛋白。其他切割位点：Xa因子（FactorXa）和肠激酶（PreScissionProtease,enterokinase）99ppt课件②组氨酸标签表达载体利用组氨酸标签的表达载体有很多，如pET-16b。主体框架与pET-5a相似，除了多一个lacⅠ基因外，启动子下游含有一段编码6个组氨酸的序列和编码Xa因子酶切位点的序列。当外源基因插入到BamHⅠ等位点后，在BL21（DE3）菌株中可表达出带His-6标签的融合蛋白的。多聚组氨酸肽能与二价重金属阳离子结合，如镍离子（Ni2+）。将镍离子固定在树脂上，便可对带His标签的融合蛋白进行亲和层析分离。纯化的融合蛋白再用Xa因子处理，可去除标签多肽获得纯化的目的蛋白。100ppt课件组氨酸标签表达载体pET-16b图谱及其克隆和表达部位的序列101ppt课件克隆和表达部位的序列102ppt课件③内含肽标签表达载体将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽（intein）中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白酶水解就可将标签蛋白切除。例如载体pTWIN1，利用T7噬菌体启动子，其后依次为几丁质结合域（chitinbindingdomain,CBD）、intein1、多克隆位点、intein2和CBD。103ppt课件表达载体pTWIN1工作原理及其产物纯化示意图过柱、洗涤目的蛋白内含肽1内含肽2内含肽1目的蛋白目的蛋白T7启动子几丁质结合域洗脱pH7，室温，自然水解几丁质几丁质结合域多克隆位点克隆、表达104ppt课件④分泌表达载体表达的蛋白分泌到细胞外或细胞周质区中。可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋白正确折叠，或去除N-末端的甲硫氨酸，从而达到维护目的蛋白活性的目的。利用信号肽序列作为融合标签可将融合蛋白分泌到细胞外，可利用的信号肽有碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质A的信号肽。pEZZ18表达载体利用了蛋白质A的信号肽四、载体（Vector）

2.大肠杆菌表达载体105ppt课件分泌表达载体pEZZ18图谱表达元件:Plac

蛋白A信号肽（S)

蛋白A的ZZ功能域纯化方式：固定了IgG的琼脂糖柱，与ZZ功能域结合106ppt课件pEZZ18表达元件:lac启动子、蛋白质A的信号肽序列和两个合成的Z功能域（domain）。蛋白质A:来自金黄色葡萄球菌，具有与抗体IgG结合的能力，Z功能域就是根据蛋白质A中结合IgG的B功能域而设计的。融合蛋白表达后，在信号肽序列的指导下，分泌到培养基中。用固定了IgG的琼脂糖层析柱，通过与ZZ功能域的结合而得到纯化的融合蛋白。这个14kDa的“ZZ”肽链对融合蛋白的正确折叠几乎没有影响。107ppt课件3.穿梭载体穿梭载体（shuttlevector）是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体，如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在E.coli中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。这类载体主要是质粒载体。四、载体（Vector）

3.穿梭载体108ppt课件(1)大肠杆菌/革兰氏阳性细菌穿梭载体大肠杆菌/革兰氏阳性细菌穿梭载体是典型的穿梭载体，其作用主要是将目的基因转移到芽胞杆菌或球菌中去。枯草芽胞杆菌是Gram+细菌的代表种，应用于该细菌的穿梭载体的质粒复制区主要来自球菌或其他芽胞杆菌。109ppt课件大肠杆菌/革兰氏阳性细菌穿梭载体pHT304图谱pHT304是应用于苏云金芽胞杆菌的穿梭载体构成:在克隆载体pUC18中插入了在苏云金芽胞杆菌中起作用的苏云金芽胞杆菌质粒的复制区oriBt和来自金黄色葡萄球菌的红霉素抗性基因ermr。110ppt课件(2)大肠杆菌/酵母菌穿梭载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体，含有分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点与选择标记，另有一个多克隆位点区。此类型的载体既可在大肠杆菌细胞中复制，也可在酿酒酵母细胞中复制。可实现在两种不同的寄主细胞之间来回转移基因，并单独或同时在两种宿主细胞中研究目的基因的表达活性及其它的调节功能。111ppt课件Beta-半乳糖苷酶启动子PGAL1CYC1TT:transcriptionterminatorofS.cerevisiaecytochromeC1gene细胞色素C1

112ppt课件五、获得目的基因的方法■基因操作中大分子的分离和分析■PCR技术■基因文库构建■基因的序列分析第二节基因工程与环境污染生物治理113ppt课件（一）基因操作中大分子的分离和分析1.DNA的分离、检测和纯化主要涉及两类DNA，其一是目的物种或细胞的基因组DNA，其二是克隆载体和装载在载体中的克隆化基因。五、获得目的基因的方法（一）基因操作中大分子的分离和分析114ppt课件①细胞基因组DNA提取双链DNA由于是很长的线性分子（如人的染色体DNA平均长度为100～150Mb）而且缺乏横向的稳定性，因此很容易断裂。防止机械剪切力。酚抽提法：以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要行透析或沉淀处理，获得所需的DNA样品。CTAB法:采用机械破碎细胞，然后加入CTAB分离缓冲液将DNA溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。CTAB:CetyltrimethylAmmoniumBromide溴化十六烷三甲基铵115ppt课件②大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化碱裂解法提取E.coli质粒DNA溶液Ⅰ:细胞悬浮液,含有50mmol/L的葡萄糖溶液Ⅱ:细胞裂解液，0.2mol/LNaOH和1%SDS溶液Ⅲ:高浓度的醋酸钾缓冲液（3mol/L，pH4.6）核心原理，在碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下做复性处理，变性的染色体DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。116ppt课件通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA核心技术是使用一种特制的微型离心纯化柱（QIAprepspincolumn），在柱中有一种特殊的硅胶膜（silicamembrane）。在高盐条件下该膜可以结合多至20μg的DNA，最后用小体积的水或低离子强度的缓冲液可将DNA洗脱出来。分离纯化过程是通过一个简单的结合-洗涤-洗脱程序来完成的。首先用碱裂解法获得质粒DNA粗制品，之后将样品通过纯化柱的硅胶膜，使之吸附质粒DNA。然后用50%乙醇洗涤滤膜，洗去杂质，最后用少量洗脱缓冲液或水洗脱出纯DNA。117ppt课件Qiagen质粒DNA纯化试剂盒工作流程118ppt课件2.RNA的分离、检测和纯化对于基因操作来说，涉及到的RNA主要是mRNA，而mRNA在细胞中的含量又是最少的。一个典型哺乳动物细胞约含10-5μgRNA，其中80-85%为rRNA（28S、18S和5S三种rRNA），其余15-20%主要由各种类型的低相对分子量RNA组成（如tRNA、核内小分子RNA等）。mRNA为总RNA的1-5%。同时由于mRNA是单链的，容易受到核酸酶的攻击，导致在RNA的操作过程中易于遭遇降解的厄运。五、获得目的基因的方法（一）基因操作中大分子的分离和分析119ppt课件控制潜在RNA酶的活性溶液和用具的去RNA酶的处理耐热物品：高温干热灭菌。微量移液吸头和微量离心管：湿热灭菌，用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水浸泡后再灭菌，或购买无RNA酶污染的用具。电泳用具：洗涤剂洗涮干净，再用3%H2O2和0.1%DEPC处理的水浸泡，清洗干净。可能接触RNA的溶液，要求用DEPC处理的水配制。RNA酶抑制剂的使用为了进一步防止RNA降解，一般在RNA样品和RNA反应中加入RNA酶抑制剂，如人胎盘RNase抑制剂、氧铜核糖核苷复合物（完全抑制剂，且抑制体外翻译）和硅藻土（RNase吸附剂）。120ppt课件RNA的抽提和纯化酚-异硫氰酸胍抽提法TRIZOL试剂：主要由苯酚和异硫氰酸胍组成。对任何生物材料的RNA提取，首先研磨组织或细胞，或使之裂解；加入该试剂进一步破碎细胞并溶解细胞成分，还可保持RNA的完整；加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离；收集含RNA的水相；通过异丙醇沉淀，可获得RNA样品。硅胶膜纯化法由Qiagen公司设计，其设计思路与DNA的分离纯化思路相似，也就是含有目标核酸的细胞破碎液通过硅胶膜时，RNA吸附在硅胶膜上，从而与其它细胞成分分开，然后在低盐浓度下RNA可从硅胶膜上洗脱出来。121ppt课件mRNA的纯化对于原核生物，其mRNA与其他RNA没有明显的结构差异，难以从总的RNA中纯化出来。同时，由于原核生物的基因组较真核生物来说要小的多，在做mRNA分析时，可直接使用总RNA。由于真核生物mRNA3′端的poly(A)尾与oligo(dT)-纤维素吸附，因此可利用亲和层析法分离mRNA。122ppt课件3.核酸的电泳技术（1）DNA的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖（agarose）是从海藻中提取的一种线状高聚物，在高温水溶液下会溶解，在常温下凝固并形成一定大小孔径的惰性介质。在0.7%的琼脂糖浓度下，对0.8-10kb的DNA分离效果最佳。五、获得目的基因的方法（一）基因操作中大分子的分离和分析123ppt课件（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可分离100bp-1kb大小的核酸分子，对单链核酸来说，其分辨率可达1bp。由丙烯酰胺和N，N′-亚甲双丙烯酰胺经过聚合而成的高分子聚合物，其聚合度由浓度和二者的比例决定。主要用来检测小分子核酸的大小，或在同位素标记的情况下分析单链核酸，如分离寡核苷酸探针、S1核酸酶产物分析和DNA测序等。124ppt课件（3）脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳（PFGE）可有效地分离大相对分子质量的DNA的片段，是琼脂糖凝胶电泳的改进方式，是专门针对大片段DNA的分析检测方法，广泛应用于染色体分析和作图。脉冲场凝胶电泳是一种交替变化电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场方向，使DNA分子在微观上按“Z”字形向前泳动，从而达到分离大相对分子质量的DNA片段的目的。125ppt课件126ppt课件（4）RNA的电泳检测通过测试OD260来判断RNA的浓度和纯度.OD260为1时相当于浓度为40μg/ml。通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析RNA。琼脂糖凝胶电泳为保证电泳过程中RNA的迁移率与其相对分子质量呈线性关系，RNA分析是在变性的条件下进行的。常用的变性剂为甲醛。聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用来分析小相对分子量的单链核酸，如小相对分子量RNA、寡核苷酸、DNA序列分析等。变性条件可用加热方式，或使用尿素等变性剂。127ppt课件128ppt课件4.分子杂交分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其相对分子量的大小。根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern杂交和Western杂交等。在3个主要的分子杂交过程中，都采用了印迹转移（blotting）这一核心技术，都是先将DNA或RNA或蛋白质样品在凝胶上进行分离，使不同相对分子量的分子在凝胶上展开，然后将凝胶上的样品通过影印的方式转移到固相支持物也就是滤膜上。五、获得目的基因的方法（一）基因操作中大分子的分离和分析129ppt课件（1）Southern杂交①Southern印迹转移将DNA片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜的方式。当目的DNA经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳后，在0.4mol/LNaOH碱性条件下变性，再在1.5mol/LNaCl、1mol/LTris（pH7.4）条件下中和，使DNA仍保持单链状态。通过毛细管渗吸、电转移或真空转移的方式，将凝胶上的DNA原位转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。130ppt课件Southern印迹转移装置图131ppt课件②分子杂交将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂交液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。将标记的核酸探针与滤膜结合。如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去后，通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的DNA分子及其相对分子质量。132ppt课件DNA的杂交133ppt课件（2）Northern杂交总体过程与Southern杂交相似，只不过在Blotting过程中转移的是RNA而不是DNA。Northern杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的mRNA分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。134ppt课件（3）Western杂交将蛋白质样品从SDS凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法，称为Western印迹转移。杂交过程是通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质。探针是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。135ppt课件（二）PCR技术■PCR技术原理和工作方式■PCR产物的克隆■PCR扩增未知DNA片段■与反转录相关的PCR■实时定量PCR五、获得目的基因的方法（二）PCR技术136ppt课件1.PCR技术原理和工作方式(1)基本要素和扩增原理待拷贝的DNA称为模板，它可以是双链DNA也可是单链DNA，最后扩增得到的产物是双链状态的。在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。DNA聚合酶在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。137ppt课件(2)PCR方法■PCR是在体外通过酶促反应快速扩增特异DNA片段的技术。PCR反应分三步完成：第一步：90℃高温下，使混合物的DNA片断因变性而成单链。第二步：50℃温度下，引物DNA结合在适于配对的DNA片断上。第三步：70℃温度下，由合成酶（DNA高温聚合酶）催化，从引物开始合成目的基因DNA。138ppt课件PCR操作流程139ppt课件(3)DNA聚合酶①TaqDNA聚合酶来自嗜热古细菌的嗜热水生菌（Thermusaquaticus），分子量为94kDa，为单分子酶，在75℃活性最强。具有5’→3’合成活性和5’→3’外切活性，但是无3’→5’外切活性。在95℃的半衰期为40分钟。启动PCR反应的能力很强，聚合速度快，在72℃的聚合速度为每秒30-100碱基。由于没有3’→5’外切活性，在扩增过程中有8.9×10-5-1.1×10-4错配率。140ppt课件②VentDNA聚合酶美国NewEnglandBiolabs公司从潜水艇排气孔（Vent）中分离的超级嗜热菌-能生长于98℃中的Thermococcuslitoralis中分离纯化得到的，故名Vent酶。酶分子为85kDa，具有更长的半衰期，在100℃（使用MgSO4）时，其半衰期为1.8小时。由于具有3’→5’外切酶活性，在一定程度上保证其具有很高的保真度，比TaqDNA聚合酶高5-15倍。141ppt课件2.PCR产物的克隆(1)在PCR产物两端添加限制性酶切位点为了使PCR产物能够方便的装载到克隆载体上，可在扩增的过程中在其两端添加限制性酶切位点。在设计引物时，除了考虑正常的特异性序列外，还可在引物的5‘末端添加酶切位点的序列以及保护序列。在选择酶切位点的种类时，要保证所选的酶切位点在扩增的DNA片段内部不存在。一般情况下，在酶切位点的外侧添加3-4个碱基的保护序列可保证切割顺利进行。142ppt课件(2)A/T克隆法无须在产物末端添加酶切位点，对任何引物扩增的产物都可以克隆。主要适用于TaqDNA聚合酶扩增的产物。Taq

DNA聚合酶具有末端转移酶的活性，可在DNA片段的3‘末端添加一个核苷酸，通常为A。最常用的T-载体有pGEM-T和pGEM-TEasy。这些载体特点是，将普通的克隆载体切成线状，并使之在3‘末端含有一个凸出碱基T。143ppt课件用于PCR产物克隆的T载体pGEM-T图谱144ppt课件3.PCR扩增未知DNA片段当获得一段DNA后，若要得到与其相邻的未知DNA片段，可通过染色体步查来完成。染色体步查是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步获得或探知其相邻的未知序列或与已知序列呈共线性关系的目的序列的核苷酸组成的方法和过程。五、获得目的基因的方法（二）PCR技术145ppt课件(1)反向PCR反向PCR（inversePCR）是一种简单的扩增已知序列周边未知序列的方法，其扩增原理见图。首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再将酶切后的DNA片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段。根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的DNA片段扩增出来。146ppt课件反向PCR原理示意图147ppt课件(2)利用接头的PCR这类方法的第一步通常都是将基因组DNA用限制性内切酶切割，然后将序列已知的接头片段连接到酶切片段两端，以提供PCR需要的另一端引物。根据已知序列设计的引物和根据接头序列设计的引物，可将已知序列侧翼的未知序列扩增出来。148ppt课件利用3′末端修饰的接头扩增未知DNA片段接头一端为平末端，另一端为长长的5′突出末端，而且在3′凹端带有一个修饰的氨基（-NH2），修饰的末端在PCR扩增时不能作为引物启动DNA的合成。首先选择合适的酶切位点酶切总基因组，将人工合成的接头连接在酶切片段两端，然后再做PCR扩增。PCR扩增的引物是根据接头的突出末端序列而设计的引物LP1和LP2，以及根据已知序列设计的引物SP1和SP2。149ppt课件4.与反转录相关的PCRRT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、OligodT

及基因特异性引物中的一种。五、获得目的基因的方法（二）PCR技术150ppt课件(1)cDNA5′末端的快速扩增cDNA末端的快速扩增（rapidamplificationofcDNAend,RACE）

首先测定已经得到的cDNA的核苷酸序列，根据这个序列设计一个与靠近5‘末端区域序列对应的特异性引物（如GSP1）并以这个引物引导反转录合成新的cDNA第一链。然后用RNase降解模板mRNA，并纯化cDNA第一链；用末端转移酶在cDNA第一链3′末端加上同聚物尾，如polyC，最后用特异性引物GSP2和复合引物（该引物由两部分组成，靠3′末端为同聚物G，靠5′末端为带有酶切位点的固定序列）对加了尾的cDNA第一链作PCR扩增，从而得到含有cDNA5′末端的DNA片段。GSP:genespecificprimers151ppt课件

5′-RACE原理示意图152ppt课件(2)cDNA3′末端的快速扩增利用类似5′-RACE的3′-RACE方法可以快速扩增cDNA的3′末端序列。首先用一个接头引物合成cDNA第一链。该引物由两部分组成，靠3′端为同聚物T，靠5′端为带有酶切位点的固定序列。然后用RNase降解模板mRNA，纯化cDNA第一链；用接头引物和根据已知序列合成的特异性引物GSP对cDNA第一链作PCR扩增，从而得到含有3‘末端的DNA片段。153ppt课件3’-RACE原理示意图154ppt课件(3)差异显示PCR差异显示PCR（differentialdisplayPCR,DD-PCR）是用于检测相似生物材料的基因表达谱差异的一种方法，是PCR和反转录有机结合并深化应用的产物。其包括3个基本步骤和2个附加步骤，如图所示。155ppt课件DD-PCR原理示意图

A．DDRT-PCR分析的原理。N代表4种核苷酸的任何一种，V代表除T之外的其他核苷酸。B代表除A之外的其他核苷酸。B．证实差异调节及鉴定差异表达基因的DDRT-PCR分析的实验流程图。156ppt课件DDRT－PCR原理总RNA反转录酶锚定引物叶子花总RNA反转录酶锚定引物产物A产物B锚定引物随机引物标记_+AB克隆验证测序157ppt课件5.实时定量PCR通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好地推算模板的起始浓度。这种工作方式就称为实时PCR（real-timePCR）。同时由于在检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，所以亦称实时荧光PCR或实时荧光定量PCR。该技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司设计并推出，其应用不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃。五、获得目的基因的方法（二）PCR技术158ppt课件实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实现了实时监测PCR整个进程，对起始模板进行定量分析的方法。159ppt课件与普通PCR的区别■普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。■实时定量OCR技术：实时监测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。160ppt课件161ppt课件Ct值Ct值得定义：扩增产物的荧光信号达到设定的阈值所经过的循环次数。此时，扩增是呈对数期增长。162ppt课件163ppt课件荧光标记方式SYBR荧光染料SYBR荧光染料（SYBRGreenⅠ）可结合到双链DNA的小沟中，与双链DNA结合后才发荧光，不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号。因此，通过荧光强度的变化，可探测产物增长的数量。164ppt课件（三）DNA文库的构建基因文库（也称DNA文库）是指某一生物体全部或部分基因的集合，像一个没有目录的“基因图书馆”。某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库（genelibrary）。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主等3个部分组成。按照外源DNA片段的来源，可将基因文库分为：基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）和cDNA文库（complementaryDNAlibrary）。五、获得目的基因的方法（三）DNA文库构建165ppt课件1.基因组DNA文库的构建流程构建程序包含：

①载体的制备；

②高纯度大相对分子质量基因组DNA（highmolecularweightDNA,HMWDNA）的提取；

③HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGEsizeselection）；

④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；

⑤重组克隆的挑取和保存。166ppt课件2.cDNA文库的构建(1)cDNA文库的特征和发展将来自真核生物的mRNA体外反转录成cDNA与载体连接并转化大肠杆菌的过程，称为cDNA文库的构建。从cDNA文库分离基因比从基因组文库中分离基因更具优势。cDNA文库具有时空特异性，cDNA文库反映了特定组织（或器官）在某种特定环境条件下基因的表达谱，因此对研究基因的表达、调控及基因间互作是非常有用的。五、获得目的基因的方法（三）基因文库构建167ppt课件(2)cDNA文库的构建cDNA文库的构建共分4步：

①细胞总RNA的提取和mRNA的分离；

②第一链cDNA合成；

③第二链cDNA的合成；

④双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖。168ppt课件