植物基因工程

1第六章植物基因工程幻课程危基因富工程寄原理授与技嫌术旱班级洁生物折科学江05暮生物怕技术坊05嫂教师书詹亚感光革范桂聋枝拔学期蝶第斧二捕学期谷课时锁6氏学时袖上课殃日期屠课的蜻类型蹈理论下授课限章节俊第难六膛章勇植踪物基竭因工晒程丸〔即1填〕司植物仿基因雅转化更受体饼系统产的条仪件逃〔侦2趣〕衰植物疲基因宁转化脑受体骗系统争的类速型和插特性你。句〔驱3腥〕糖植物答基因抓工程头载体克的种参类和拣特性禁〔桥4机〕猎根癌苦农杆遭菌摸Ti陆质粒情的结阔构与愧功能攻：重T-墙DN制A秧、检Vi签r胃区操盘纵子碰的基服因结花构与趟功能元。婆〔似5晨〕沿农杆睡菌初Ti撒质粒接基因丈转化叼机理泊〔迈6绩〕吩农杆惭菌华Ti斧质粒琴的改歪造及撤载体站构建竞〔堡7灾〕搭载体昏构建手中常绢用的巧选择胁标记役及报义告基竭因点〔其8寿〕蝶根癌断农杆闸菌的慢转化雄程序袋及操棋作原类理乖〔虽9获〕谜外源省基因恼在植沃物中罩的表孙达臂教学岁目的故和要拾求恋了解盏植物夹基因葡转化胖受体世系统语的类圆型、妈特性妄掌握习Ti编质粒毯的结使构与请功能澡，植端物载妖体构腔建原故理，放植物玩基因季工程那常用劳的载贺体类详型。筑教材州分析某重点尸根癌鲜农杆触菌索Ti祝质粒伞介导乳的基秆因转脖化的狸原理左和方阶法使难点锄植物勇载体些构建都原理搜关键受点挣转基语因植帐物的住获取到和检脏测帽主要户教具带和设公备材些料非投影槐仪、训电脑侨、常资规教批学设捧备歉教法纯板书顾与多盼媒体球授课孤相结才合炮思考通题问1.怜吹植物绪基因获工程妹载体辣种类梯？偶2.柜女根癌序农杆四菌转奥化程端序鸟？矩心得在自然界的许多双子叶植物中，常常发生一种严重危害植物生长的病害——冠瘿。90多科，600多种双子叶植物都能感染这种病。一般认为单子叶植物和裸子植物对此病不敏感。70年代中期，世界上几个实验室发现诱发肿瘤的根癌农杆菌中含有大量的诱瘤质粒Ti(tumor-inducingplasmid),且证实了肿瘤的形成正是由于pTi中的特定片段——T-DNA转移并稳定地整合进植物细胞核基因组中的结果；由于其上载着的冠瘿碱合成基因和激素合成基因表达，因此分泌冠瘿碱并形成肿瘤。人们就把这种冠瘿的形成过程称作天然的植物细胞转化系统。农杆菌将自身的DNA插入植物细胞诱发肿瘤只对其本身是有益的，重要原因之一是因为农杆菌诱发植物细胞合成冠瘿碱为自己提供食物。植物自身不能利用这种物质，只能为它的合成付出代价，别的细菌也不能利用它，在自然条件下，只有农杆菌能分泌分解冠瘿碱的酶，将这些特异产物作为唯一的碳源和氮源来利用。肿瘤的产生是由于T-DNA上的激素合成基因所致，刺激细胞生长而产生肿瘤，这是T-DNA转入的一个副产品。Ti质粒给自己设计出一套为其自身存活的非常优秀的进化格局：它感染植物细胞，使之出现愈伤组织增生，后者便产生出供带有Ti质粒的细菌用作能源、碳源和氮源的冠瘿碱；而冠瘿碱的产生又可激发Ti质粒转移到原先没有存在这种质粒的土壤农杆菌中去，如此周而复始得到不断开展。Ti质粒是一类理想的植物基因工程载体，通过它们可以将外源DNA转移到植物细胞，并再生出能够表达外源基因的转基因植物。握Ti性质粒追还具俗有假设输干其库他载枕体所抚不具油备的畜优点毫：〔策1仔〕识T-墙DN晕A摆能够取进行社高频问的转胡移，佛而且青这种皮转移商的模DN悟A虹通常壶是以经未发磁生变暖化的婶完整倦形式花整合叔到植黎物的且核基未因组琴上。稼〔酸2粗〕港Ti隐质粒浸不存武在包豆装限沙制问承题，壮大到纵50殿kb卷的外像源干DN绿A砌也能恭顺利竭地包仍装与尾转移过。隙一、剪植物狐基因比工程剖载体希种类炸据载疑体的挎功能固和构声建过康程，皆可把敬有关耐载体畏分为亭四大阅类型酿〔九盲种载壶体〕锐。造克隆辰载体从、中爬间载邪体、制卸甲不载体饭、转至化载撒体敲据载芒体的失功能韵和构萍建过偿程，闪可把谋有关加载体滴分为身四大举类型池，九矩种载滚体。族1谢、克融隆载当体〔饮目的夸基因稍的克结隆载渔体〕少通常掩由多肾拷贝阴的谅E.品co移li对小质腹粒为梳载体出功能晶：保纤存和还克隆亩目的鞠基因笔。墙2栽、中恭间载倍体又用分为因中间六克隆匀载体滋和中坏间表杰达载罢体。贿中间拍克隆皆载体趟：由狱大肠为杆菌找质粒画插入疤T-织DN条A废片段禽及目例的基谣因、甚标记益基因貌等构轻建而稼成。愧功能羞：构溜建中狸间表浆达载恰体的自根底枕。曾分为享：中童间粘构粒载控体、蚕质粒偷粘粒赵愈合胸载体仙、基墓因标倡记载糊体。朱中间因表达准载体魔：含慌有植段物特菌异启群动子茂的中银间载醒体说功能弓：作良为构鼻建转喊化载捎体的箱质粒估。董3携、卸活甲载防体茂解除割武装锈的浅Ti寨质粒猪或进Ri带质粒图。〔斯on算c+疲-铅--猾--钢--种-煤腥on雨c-怪〕疾功能嗽：作龄为转课化载焰体的悬受体尝质粒导4这、转拆化载饱体苗最后蚀用于恼目的稀基因独导入奔植物监细胞蜓的载绞体，榴亦称端工程幼载体诊。养它是梦由中忽间表尘达载平体和耗卸甲偷载体垄构建驰而成池。宏分为将一元男载体界系统猛〔顺固式载沙体〕细和双缎元转盐化载不体系壳统〔狭反式蛇载体努〕。阔一元酿载体换系统读包括咽共整俘合载许体和豪拼接疮末端抬载体厘〔锅SE迈V行〕。脆二、烈根癌哭农杆赔菌成Ti困质粒竹1财、彼Ti宾质粒搂的类盐型、壶结构文与功形能尊〔蝶1累〕类晃型散Ti馆质粒董是根远癌农湾杆菌仍染色萝体以告外的速遗传辰物质照，为幅双股纽共价练闭合矩的环混状啄DN搜A源分子水，分球子量邪为被95勒~1两56绝x召史10鼠6D涂，约歇15箩0抗~毛20恩0鲜Kb瓣长。岩根据兽其诱勺导的亭冠瘿侦碱种万类不购同，貌Ti杯质粒竭可分废为三姐类：打章鱼脊碱型匀〔衫oc悉to杂pi项ne吩〕：浮pT燕iA尼ch品5,梢p碍Ti戚A6还NC冬,供pT判iB奇65熊3,陈p滑Ti陪Ag辣16走2恢胭脂准碱型匙〔察no同pa曲li喘ne炊〕：歉pT报iT闪37砍,岩p端Ti嘉T3太8,脖术pT饰iC留58良农杆挥碱型吼〔日ag筹ro欣pi杆ne盾〕和绸农杆坡碱素丙型〔羞ag批ro橡ci纵no否pi阳ne躬〕或将琥珀拜碱型罢〔牢su总cc姥in概am豪op扶in绒e得〕处〔怜2犁〕结棵构和木功能采各种显Ti想质粒夹都可闭分为石四个码区：抵①宁T-田DN钢A仔区〔务tr踩an叹sf评er闲re悲d-秀DN液A扛re缩gi监on棋s灭〕：揭是农辰杆菌新侵染处植物戒细胞喝时，野从恭Ti魔质粒叶上切张割下普来转分移到港植物拨细胞抢的一期段纳DN狼A识。该遮DN寻A怎片段血上的着基因蚊与肿核瘤的嘴形成随有关部。粘②月Vi醒r杨区〔通Vi匙ru傅le涂nc愈e口re繁gi捞on星〕：凉该区降段上惭的基避因能诞激活适T-博DN期A汁转移悠，使抢农杆钞菌表满现出执毒性抄，故洽称之绿为毒什性区丙。是T-润DN贩A日区与蚀vi勤r弦区在针质粒肚上彼资此相饲邻，棚合起妥来约亦占阅Ti际质粒肌DN切A白的非1/混3扬。绩③怠Co债n荣区〔系re辱gi惭on钞o卫f城re远pl忠ic剥at谱io现n雁〕：眠质粒寨结合漫转移跟位点猜编码威区，竖该区吼段上润存在永着与储细菌台间接训合转罗移的谊有关园基因帐〔志tr诞a净〕，错调控盟Ti止质粒由在农誉杆菌衣之间船的转钻移。斑冠瘿歇碱能丈激活续tr信a酬基因快，诱正导风Ti萝质粒淘转移次，因踢此，顺称之拨为接纳合转陶移编浩码区祥。戏④温Or芳i知区〔倍or垄ig劳in内痰of除贵re号pl仔ic迎at瓜io吐n厅〕：草该区你段基列因调怨控均Ti新质粒嫩的自贪我复弹制，管称之庙为复链制起型始区施。屯3屑种成语分与在Ti项质粒寿肿瘤雪诱导誓有关浆:美T-齐DN闯A垫：它盘可转内移至谋宿主阿细胞检，是迈一种联可移露动因裹子。丸毒性根区：呆vi给r声基因遣可产女生转以移活梨动蛋也白，灰对增获强植行物细揭胞的客转化慰是必闲须的星。诚土壤玻农癌司杆菌天染色浙体基森因畜:格间接破参与稳转化或，负密责将联细菌界细胞岂接合以于植哨物上诵。笛2汪、蔽T-意DN白A征的基罗因结粮构和丽功能挽〔桨1驻〕夺T-悲DN设A且的结焦构特托点链长约抱23砍Kb胜在赏T-盲DN隔A帝的狸5’以和许3’丽端都向有真独核表爷达信烧号，菌如山TA光TA厦bo趁x颤，注AA馒TA版Ab陡ox辫及步po艰ly雄A寻等。沃T-萝DN疾A订的两洗端左递右边搂界各杀为窜25已bp喘的重渗复序坚列，慌即边玻界序浴列，径分别惹称之备为左虹边界涨〔织BL扔或墓TL奥〕和度右边债界〔膊BR耻或摔TR搂〕。能该根25贸bp渐边界艺序列撑属保静守序籍列〔扎TG顷AC舍AC孩GA珠TA玉TA个T软TG怒GC削GG待GT窑AA溉AC梅〕。御通常沿右边比界序笛列更校为保艘守，洒左边娱界在扣某些垦情况饰下有恶所变酬化。随左边辱界的饱缺失叠突变伏仍能存致瘤秩，但失右边灵界缺打失那么面不致棍瘤，挑这时棵几乎勿完全宏没有丹T-亚DN努A果的转宣移，奔这说兰明右成边界遮在穴T-仍DN秤A奴的转粉移中挤的重子要性到。右胭脂弹碱型暖肿瘤愧，为免一连障续的哥一段穷序列炼，长坑约狼23雾.4斜Kb动，有贷肿瘤红系，字仅一曾个拷滴贝，宫有的稳T-割DN刊A马是多李拷贝粮的。退章鱼宝碱型去肿瘤输：发T-绳DN使A泥分左葵右两恒局部黑〔隐TL疗-D哗NA深和盲TR透-D压NA骆〕，算各自脉带有找左右搂边界河序列花。左登区的达顺序替变化条不大暗，长医度约剧13撤Kb吧，通熟常一齿个拷励贝，饮但也这有几楚个拷千贝首菊尾相耗连排繁列。胜含章但鱼碱舱合成篇酶基嘴因和扛致瘤壁基因降。隙TR颠-D肺NA弯较短越，长努约曲6-店7K徐b径，拷汁贝数态达数迷个纺或数飞十个塞，有拾的肿偏瘤系疮中没监有柔TR注-D漠NA意。象TR举-D银NA例编码里5续个基吓因，的如甘抗露碱绿和冠戴瘿碱摩合成乔酶基泥因。市〔互2联〕然T-远DN疏A必上的宅编码色基因扎及功而能戚章鱼碰碱型守和胭薄脂碱炭型啊T-慨DN宵A吗的转尿录有电下述闯共同齿特点抄：朗T-易DN杰A昌的两痕条链凭都是饰有意槐义链乎；领T-追DN浪A恒上每除个基食因都嫩有各肢自的滚启动侨子；华基因末的转稀录由芦植物违细胞膛RN歪A快聚合芬酶艰II抵完成常；津T-梨DN转A叔具典孕型的早真核使生物菊RN豆A渔合成嫩起始订和终婚止的说调节尼信号诞，在添其牵5’慢端转丹录起要始处约有偏TA捕TA秒和茧CA旧AT扑盒。找另外眠，至神少在议5同个提T-摘DN闪A高基因请中发佩现有伪一个厘8b临p阔的相巧同顺汽序〔先TT寿TC聚AA次G锋A控〕，蒜同时绸AA能TA仇AA带加尾傅信号避也在之同一矩条链驱上发湾现。徒植物奔或农做杆菌宴中可谎能有游甲基加化或较去甲生基化纷的调浴节基炼因活条性。白3亿、贩Vi鞭r贡区操需纵子碧的基块因结治构与川功能秤毒性闹区的把大多变数基大因产圈物都嚼控制鲁T-流DN舌A汪的转音移，江这个被区域山的突坑变往师往导板致农腐杆菌梦感染疤植物帜能力蜓的下行降。毒〔佛1旬〕衔Vi压r参区操纪纵子需的基靠因结掀构袜章鱼餐碱型句Ti柜质粒拒：释Vi话r谢区大学小为站40茎kb民，含毕有锄Vi源rA砖、文B沾、锈C泛、微D掀、还E颠、尼F祝、粘G但、疯H够〔粗Pi自nF巷〕等激8甘个操楚纵子流，共示24象个基歇因。校大多毯数操耽纵子惭含有裹多个畜基因景Vi央rA嗽〔科1灶〕、仗Vi圈rB协〔亡11康〕、游Vi惨rC刻〔察2救〕、与Vi浩rD攀〔忽4近〕祸Vi漂rE腥〔舒2踏〕、松Vi便rF疯〔衫1滨〕、视Vi灭rH斜〔狮2钢〕。鹊胭脂飞碱型近Ti跨：有斯7茎个操榨纵子富，少能一个奉Vi处rF尊，它丧们的遍第一你个操篇纵子农也不及同，者章鱼扒碱型译Ti需是韵Vi独rH墨，而测胭脂吧碱型奔Ti容是蹄Tz架s轮，其诱功能堵也不巨同。微Vi砖r丽区基钥因的便表达引有两伸种方钳式：由组成隆型表榨达；限在无番植物灵诱导时分子吩存在第下依卧然保宇持一炕定的凡表达誉水平抱，腹vi谜rA吉，蜡vi疤rG协、凭vi壶rH宏诱导奥型表薪达：贝这些怪基因守的表针达必锋须在穿土壤返农杆谅菌感秘染植告物时薄，在巷植物挡受伤价组织偶分泌寄的信赏号分糊子作标用下骑才能醉启动蛙表达领，如睁vi饺rB伴、锅C萝、书D路、围E翼vi民rG驱虽属映于彻组成半型表祖达，甚但有冶植物伶信号恭分子豆存在唤下表灶达量如提高毯10爱倍，增也具艰诱导蒙表达旁特性筹。糕〔琴2纹〕饼Vi伶r标区操身纵子承的基饰因的你功能祥①害Vi文r筑A涂单个即基因如，匆2.座4k告b割，仅融编码授一条垦多肽杂。授Vi与r皆A舍编码廉一种产结合狡在膜贷上的喜化学纹受体部蛋白铸〔叛92冶KD控〕，驼可直凡接对慰植物援产生唐的酚答类化拒合物怀感应腿，是岁一种田感应伪蛋白谱。青Vi可r谣A沿的活拦化：扎当饮AS蠢与券Vi猴r卫A蔑的受效体部现分结此合后根，会料使整言个泉Vi键r横A唉蛋白遇构象据发生朝变化叶，其云C吹端活换化。子Vi养r炼A劳蛋白烂的胞凡质区召有自巡激酶插的功屡能，颠可在筐保守斥的组盯氨酸堂残基坐上磷胞酸化权，从睬而遍Vi谢r愤A敏蛋白保被激赢活。叙激活拌后的灯Vi风r齐A肌具有嚼转移失其磷白酸基部至逆Vi判r弦G堤蛋白宇的一避个宿练存的哪天冬攀氨酸三残基睡的能枯力，鲜使澡Vi族r墨G吼蛋白井激活述。器②怀Vi欲r谢G侍Vi谎r霸G器，只恐有透1K戚b狠，单玩基因遥，编梢码薄DN倘A圾结合栽蛋白削,膊其师C脊端有群DN莫A象结合氏活性登，础N谷端具循有磷设酸化懂的酸婚性结赠构。萝从总驰体效科应讲栋，指Vi叼r倡G鸟基因把是属灿于组屠成型院表达欧的，塘这对琴于细磁菌迅玻速地汤将外夏部环轻境信屋号传坦递到然细胞史内十浊分有圾利。纯当磷货酸化惊的治A怖蛋白族将其污磷酸桂基转绘到三Vi走r趣G涌保守佛的天盟冬氨菠酸残忠基上头时，亩使鞋Vi械r务G彩蛋白曾活化禾，活车化经Vi升r凭G初蛋白土可以特二体钩或多剧体形绣式结粮合到槐Vi亚r冻启动验子的娃特定母区，肝从而识成为炒其它螺Vi劈r果基因笨转录命的激担活因惠子，狗翻开桑Vi锹r瞧B免、秘C举、黄D定、盖E雪、尊H诉等几倚个基腐因。颂Vi倡r配A轧或验G遥突变谅后会途减弱倒或完叹全失嚷去对挤其他脆Vi您r瑞位点葡活化轧的诱共导，即Vi苍rA录及尿V译ir罚G滴销的这舟种调转控作衣用被章称为昌双因证子调缎控体笋系。漠Vi寨r愿H难、巾Vi元r椅F棒及宇Tz岗s辈这些非基因叶对质通粒是借特异桶的，填在章悲鱼碱廊型中工有店Vi宪r之F性、开Vi爷r超H旬，在闹胭脂唉碱型届中有爷Tz赶s捎。辜V肿ir粉H励：对意植物旺产生晋的某阅些杀步菌或松抑菌真化合延物起狐解毒艰作用旁，从乏而使第自身奇生收不受接抑制析，可拖增强段致瘤绪能力赴。呼Vi龟r狼F码：编埋码一惯个重23诊KD去蛋白脾，通咬过细Vi肆r福系统裙传递燃到植征物细投胞中怎，对志T-抵DN志A禽起运坝输作沈用。辫Tz魄s浊：大荣局部茂胭脂岩碱型晒菌株剥的慎Ti播质粒甚上均么有贪Tz纹s量基因够，转葛运玉哈米素扭合成覆酶基论因，趟在细想菌中孩表达桐后将撕玉米戒素分桨泌到那么细胞寨外。装该细烂胞分外裂素拒被植肥物吸驶收后望，能亦促进么农杆运菌感网染部腔位的变植物扣组织凭脱分削化和公细胞举分裂记，提边高植红物对粮农杆壤菌转促化的牙感受的性。苗三、映农杆篇菌位Ti甘质粒牵基因闹转化焦机理霜1件.狼T-按DN估A释的加催工及闪转移罚首先项在下咱链却25宅bp贫重复青序列糟的右誓边界宏左起闻第方3喂和第货4持碱基毛间剪枯切，基从缺途口的地3’冶端开辩始合拖成新堪的饼DN怕A蛋链，础并一侦直延踪伸到竭左边马界第过22秘bp粥处。贝置换咽出原午来的置下链申，形叫成阔ss卡DN准A个，即育T炮链。挑Vi堵rD努蛋白掩的功娱能：弓Vi裤rD长1阅及魔V鲜ir具D2挺分别傅编码默16疗KD合和掠47吃KD输蛋白朝，与熟T-贩DN腊A知的加晴工有复关，锣决定闷在边沉界重声复序版列的系特定贪位点父上形部成切俩口，卡产生等T览链断致裂。赵V晋ir讲D2胡蛋白黎的功神能：印①特现异剪县切，筹并与圣T苍链的捕5’估端共拜价结拘合。帽②导随向功钢能；胶2.烈T寇链蛋晃白复绍合体镇的形致成及腥Vi携rE穷的功暖能音T教链必亭须横掠向跨刑越细蚂菌细毛胞膜呆、细阅菌细劫胞壁挡、植颗物细赛胞壁芳、植被物细折胞膜叠及核芒膜才拆能整领合进宾植物透基因猴组。质T友链以旬一种层DN绪A-萝蛋白贡复合宫体〔押T埋复合最体〕穷的形恐式存辟在。英目前友吗至少谜两种乎Vi至r皮特异叠蛋白留即吉Vi庙rE笨2樱和读Vi治rD佳2遮与贡T亡链蛋付白复搂合体诱的形萍成有台关。移Vi羽rE屿2翠的功棋能：确编码点ss培DN爆A予结合茅蛋白哑，该缎蛋白析可非秤特异岔地一扶与任堆何买ss催DN军A型结合坝，通案过与毅T臭链非旗共价互结合州，填Vi丑rE用2虫可包啊被俯T过链形罪成细巡长的醒核妙-展蛋白姑丝，截使捎ss逼DN颗A碑抗笔3’六和劣5’任外切吩核酸广酶和扬内切煤核酸柜酶。棵3丽、冒T国链复巩合体瞒通过呆细菌理细胞丰膜的踪转运鸡及论Vi遭rB辨的功证能祸〔判1度〕牺Vi爆rB快的功闪能牢Vi既rB肉启动回子有爱11算个基灵因，瓜大多跑数编牌码跨跨膜蛋丧白或惯膜结矿合蛋缺白，膀能在炕膜上浇形成栋一种柳类似巷细菌迅接合乓转移鸡时从恰供体练菌转授至受恢体菌播所必牲须的培结构教——革接合亲孔或眯性毛坛。疯T-罢DN涨A础通过纹这种粱孔由牲细菌弟进入叠植物慈细胞衔。同亡时，蚀Vi扎rB富也可吊能起统运输侮和提蒜供能躁量的绩作用剧。牢按功抬能，赠可将占Vi轮rB咸蛋白蛾分成欠五类析：雾R智：在司内膜博上或岸内膜蚊内的翅某些她蛋白扫，可页能作搏为茶T识复合芝体的晓受体昂；撞A骆：此鞋类蛋追白可悲能作垫为能资源，追作为基一种饮AT糕P栏酶促之进饿T摸复合忆体被可泵出耻细菌泡细胞边，粱Vi铁rB乔11服可能帽是这蛋种连A塌类蛋萄白。诱C薄：形宽成通烈道的持作用尿，如熟：暑Vi拒rB宅4产是一测种富机集蛋纳白，顷无疏遵水区竟，无曲信号方肽，架可能拾在构T变链转疫运中拾起一额种结钩构作起用，庸形成志至少浸一部础分特世殊的演通道蚕结构鲜。久S殃：载沸体蛋济白，鹅起运私载桂T凝猴复合赌体穿革过通束道的干作用陆，这议类蛋兆白可曾能与及所有薯膜成括分〔煌内膜胸、外净膜及蚂周膜脉〕有临关。礼P婆：位损于外分膜上器，可暂能作肃为结幕合植缘物细剃胞膜兴的一唉种受赛体。猛〔赏2碧〕申T夕复合辆体向幼植物杰细胞誉核的古转运暖Vi吃rD饥2肺可能放以一温种极萄性方酿向，球将璃T做复合户体定跨向至宇核孔五，而怨Vi探rE纱2糕那么作品为一椅种促愉进因踩子，倘保证裹很长去的醒T悦复合快体在周进入描核孔超时不衰受干缘扰。忆在岭T-称DN喊A劳转移步过程委中，圣Vi患rD广2浮具有臣火车满头的格作用指，牵膝制毯T迹复合祖体以谅5’邪端到颜3’侍端的患方向插向核风迁移恭，而蹄Vi宫rE趋2底那么只饲助推堂器的售角色脊，帮娇助未未折叠奶的长钥形筝T须复合石物不现被打俗断，互并方齐便其号向核韵运动构。岔号Vi留rE艰2-筒ss娃DN融A五可以摧抗拒山内切乐酶的醒作用御，如枕核酸啊外切降酶尺VI乳I望对埋Vi番rE凤2-永ss务DN忌A额降解肝能力渡将相瘦当于轮对朴ss顶DN泊A比的现6%罗，对英S1彼核酸晨酶的覆效果梯也相召似。针4饺、细重菌染伸色体劈上与洽T-充D咏NA稠转移直有关假的基碑因世目前园梳农杆俭菌染法色体缘上有瞎10棋个基太因与殃T-睬DN迁A符转移想有关缝，它玻们主吉要涉劫及细贯菌与技植物赞细胞隐的接殿触和拆细菌抽向植财物伤扩口的宋趋化寸性。着ch替vE宵——宜编码义一个负葡萄炼糖和知半乳阅糖结踢合蛋涛白，铁主要勒结合宵组成航植物御细胞絮壁的删单糖柜；可坊能由芽于识仓别植健物受汉伤产针生的剧糖单角体，赚导致绸细菌让向植汽物伤流口的穷趋化拘性；脖在低礼pH科值、尿磷酸登饥饿廊条件缝下启密动晋Vi虾rG绘表达乖。民ch务vD那——香编码究一种基细菌塌AT兄P垦结合累蛋白贝，在减低施pH纯值、塘磷酸括饥饿愤条件悟下诱鸟导店Vi府rG研蛋白假设含量丈升高教，然恋后正Vi哗rA陶接受茶AS逝信号盲，刺控激首Vi测rG搞转化枯成活发性形剂式，薄启动援其他盗Vi灵rG耕尿基因卸表达晨。胃ch混vA铜畏、粘ch魄v茫B衰、捐c枯hv鄙C—均—势与环院状盈-1肯，苏2-剩葡聚许糖的刺合成质和运颂输有栗关；滩c感hv罗B瞒产物与催化把合成霸葡聚广糖，状c着hv睬A的产物丧将多滋糖从极胞质初运到黑胞外古，影陵响农间杆菌螺对植德物细封胞的斯附着遍能力慨。贱ps才cA峡和租Ex脱oc初——润与多净糖的予合成捉有关泽，并催影响渴农杆毁菌对包植物妄细胞坝的附院着能傲力。孩四、配农杆陕菌贺Ti炉质粒疫的改垦造及脾载体森构建面1臣、野脆生型默Ti确质粒给直接岂作为谣基因讲工程昏载体躬的障支碍：我〔责1鸽〕分或子量歌大，尺16税0~粉24截0K袜b衔；诊〔陷2舱〕有程各种瓦限制坐性内浩切酶箭的多花个切哄点；修〔锤3僻〕榜T-牧DN唯A就区中员含有胞许多促编码套基因暖与基准因转休移无办关，王如致睬瘤基搞因，准其存漏在还痕会导律致植姥物体输丧失闯形态雁发生蒸能力冶；蜜〔厘4执〕黑Ti挎质粒会不能枯在大寸肠杆血菌中祸复制证。滨2驰、鸭Ti净质粒继构建棉的几圆个重怖要因盾素似〔耳1孝〕右优边界胶序列复；小〔屑2殿〕完役整的建Vi岂r南基因公群；倡〔搏3定〕有填独特是的酶米切点挎；懂〔屯4币〕有旅在植甩物中瓣可表涛达的泥选择急性基尚因；扛〔完5路〕有撒在细毙菌中宰可表才达的辨选择隆性基表因；关〔袄6弄〕章鸭鱼碱似型农沾杆菌道品系内需要阵独特虚的增海强子藏。母3此、载忘体构虎建屈先将鲁T-赵DN虹A职片段自克隆透到大批肠杆稀菌质盛粒中恋，并痒插入场外源默基因类，最逗后通惹过三寸亲交菊配或吃接合蕉转移茧把外刑源基泽因引炕入农本杆菌再Ti匪质粒情上。捐Ti笛质粒投的载液体系质统分隙两类袄：一献元载桶体和泄双元厌载体轨例：傻双元邮载体吩的构活建启双元额载体稳系统命由两摩个分醉别含洽T-妖DN挠A烘和倒Vi丑r振区的堵相容夕质粒肥构成炊。贞〔瓣1断〕构集建原太理低Ti劣质粒同上的参Vi壳r来基因唤可以雄反式愧激活落T-承DN驴A来的转该移，氏T-厦DN布A摆和当Vi线r仗区处灿于不木同的脚Ti摩质粒给上同后样能允起到女转移群T-芦DN吸A粒的作杜用。欠双元付载体末含有瞒广泛断寄主愉范围阴质粒渠的复复制起吓点〔咸or江iv需〕，饺从而敌代替延了在遮共整元合载锦体中莲用以洲重组述的同算源区栋，它芹们能扒在任革何农船杆菌姓寄主蹦里自停发复趟制。霉所以淹寄主旬仅需回一套恼完整游的匆vi赛r芽质粒捞就可渐。主饭要的哥转移晌区载年在小画重组浇Ti肠质粒传上。巴〔料2屯〕微法型轮Ti协质粒侄〔另mi腰ni短-T遍i自pl觉as阵mi设d掠〕堤含有哈T-掏DN肿A瑞边界沉，缺愤失备Vi删r拦基因造的质姜粒；掀含广顺谱质换粒的罚复制越位点禽Or悄iV恢及选爬择标滩记基石因。苦〔等3滑〕辅徒助Ｔ帽ｉ质拢粒醒含薯Vi泊r敬区段竹的瞒Ti繁质粒日，庸he劝lp存er唇T版i,伸是产T-矛DN狱A望缺失饥的突颈变型应Ti间〔卸休甲被Ti艘〕，崇提供陕Vi楚r忽基因费功能掏，反匀式激谁活落T-孩DN铲A付的转喇移。体LB州A4贺40是4盟中含畅有筝pA息L4榨40业4(河pT牢iA浇ch薄5灶的衍破生质铜粒平)奔，野疫生型伐Ti闪也可迹做餐He稻lp繁er慈T沙i,啄有更抖强的涌毒性尊。均五、报根癌屯农杆蛾菌侵兰染植甚物细驳胞的江机理抄1滚、根比癌农厉杆菌刻的生层物学论特性分类房农杆钩菌属边，也觉称土省壤杆史菌属附和根莫瘤菌屈属，掩是同项属于春根瘤重科的统革兰呈氏阴聚性菌黄。靠土壤袍杆菌鸭属有偏4筹个种与：根巾癌农蹦杆菌或、放宿射形孔农杆骄菌、温毛根薪农杆韵菌和运悬钩融子农谢杆菌直。奏根癌才农杆油菌，谱根据最其诱万导植膜物细兴胞产盖生的懒冠瘿稍碱种旧类不继同可谎分为撞三种捐类型施即章艺鱼碱翁型、深胭脂释碱型萌和农翻杆碱克型。鸟生活掉习性犯土壤绑杆菌险属都蜘是土铸壤习愁居菌格，主丢要生播活在铁曾被演多种烤植物迈生活乱过的燥土壤番中，飞好氧鉴，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矮影响暴保存翠效果陪。穿懂刺培灶养的等菌种赌用蜡郊封口丝，在舌室温绞下可悔保存刷数年慨。岁长期歼保存的菌种姜：主带要采吃用甘络油保要存法选。在洒7须％二咽甲基递亚〔完DM四SO肝〕或租1待5唇％甘括油中避，菌购种可挪于林-单70时℃巨冰箱没或液弯氮中川长期怎保存昼。当僚甘油裕含量斤增加铲40其～良5邻0%扎时，赚细菌魔可在巨-馒20跳℃今或警-年70郊℃泄条件况下，喝保存烫假设干察年而彻不失访活。橡将冰野冻菌傍种从偷冰柜危中取贴出时柿，应闻当放砖在冰命浴上迷慢慢畜融化括，不峡可直能接将腥其放妙室温困下，念否那么串会导绒致菌育体失片活，抗更不箭能直买接接握种至蹄液体洒培养霉基内豪28故℃骨振荡钞培养收。惨3托、讯Vi腰r邻基因纲活化让诱导义物的居使用尸〔读1响〕诱室导物旁：拢常用谣诱导掠物是甜乙酰申丁香垫酮〔装AS氏〕和躺羟基愤乙酰漠丁香合酮〔膨OH彼－矿AS那〕，咳其中参效果骄优是坝AS违。但蝶最近路又有悲新的键发现领，有斗两种哀特殊镇化合介物比挤AS论的诱宿导活般性高孔10描～替10绍0咽倍。寄〔叔2双〕诱盏导物杆的使底用方秩法节在农商杆菌花液体幻培养挎时加糖A蝴S漂，加筐入时摩间－症般在逃制备发工程绸菌浸匹染液翼使用迫前欺4径～术6演h膊参加毙。使客农杆唇菌既谢处于肃对数禁生长取期，傍又处顿于唐vi瓦r讨基因企高度瓶活化铅状态勒，从墙而提申高侵铅染能灾力。桥也有益的在理农杆枪菌悬起浮液横离心匀后用胡植物革外植删体培桐养基搭稀释镇成侵歼染液爸时加游入。缺AS悼加在妖农杆应菌和该外植株体共乓培养慕的培泉养基婶中。股共培求养的窜过程碑是淡Ti外质粒毒实现构叫T墓-D蓝NA规转化逆时期炕。一城般农誉杆菌狗附着小脂1才6类翼h法后才笔能进倚行转驴化，而这时雪需要恒vi尚r流基因乌的高夺度活淡化。脖因此炼，许守多科扫学家胶赞成绢这种翠使用麻方法搏。塔在农唤杆菌肌液体揉培养惊基中班及共水培养伴基中好都加谷入喷AS讽。这储种方孝法似抵乎最失牢靠弟，只毫不过徐是使月用的漏AS弄诱导禁剂太朗多了考。葛〔外3任〕诱咬导物锈使用缎的梨pH皇值标pH出值对城vi报r管区的喘活化锻有着期明显林的影封响，城从理体论上香讲含妻AS勤的培关养基邻pH子值为投5表．呢0得～掉5宣．末6团时，怒存Vi托r勿区基顺因的再诱导志到达迅最高竟水平距。伴p牲H钟值改鞭变傍0报．恼3扎，即均对多值种植拴物的瞧转化堪率有古明显反影响晃。慨章鱼均碱型密和农戒杆碱妻型菌移系比孔胭脂黄碱型艘和琥虚珀碱昏型需编要更殊低的阔pH早值。揉通常巴农杆使菌培持养时映pH围值为极7你．缺2搏。这神种生痰长旺召盛的投菌株脚的欲vi邮r地基因袭均处链于不耍活化泡状态册。而免组织啦培养彼基中旦的满pH打值常低为隔5底．森8恒，有驼利于没vi卖r倡基因抄的活偶化。背在芝vi坚r粘基因忘活化呜诱导岁中应免调整绪培养返基的捎pH包值。纲4财、外挡植体珍的选坝择原Ma误ye辈r绘等指贷出，祸转化正只发贫生在芽细胞起分裂眠的一葬个较抚短的济时期软内，矿可能犬只有概处于美细胞漆分裂睛周期每的刮S听期才恋具有气外源源基因希的转谨化能温力，扇因为赌核基涉因组翻DN骗A微正在弦复制扯时才给能使借外源例DN代A叉整合宰。因容此细曾胞具部有分凡裂能冠力是插转化论的基禁本条好件。碍〔易1阵〕外底植体烫的种作类行叶片面、叶冻柄、污子叶莫、子贿叶柄弦、下左胚轴胃、茎谈、花课茎、芝匍匐这茎、乘块；扇茎尖舒分生柏组织石、芽宫、根当、合她子胚疯或体钻细胞令胚，纤以至暗成熟森的种武子等恨都可叮作为汗外植桶体转他化。贯但各抢种外骑植体证材料怖的转阳化率唉有明民显差冻异。钟贾士局荣等肿〔恨19宁92墓〕对插不同票外植胃体转结化成物功的铸例进杜行分枯析统客计结栋果表壤明，再叶片磁〔叶珠柄〕端、子保叶〔存子叶股柄〕筒、胚情轴、票茎等剪外值骂体转振化成肾功的尖事例集最多女，它评们分冲别占腰鸦35唉％、将尤9德％。舌钱句10是％和题扩17幻％。毅但是卡，不垄同植惧物的闪最正确讽外植棋体种界类不状同，山要根唱据具凭体植蛙物进宰行选脑择。陕〔拖2贴〕转逃化外翻植体钳的选灶择原争那么哑以叶致片、砌子叶友、胚浪轴为眨首选略外植涌体材巡料。燕选择森幼年斥的外赏植体揉，同广时要惠考虑愉其最留佳感驻受态尝。缸转化死外植纺体易序于组颈织培及养，湖并有干较强岛的再旁生能愉力。冰应考屋虑感久受态培细胞栗在外贞植体秒的部敏位。法一些翁复杂割器官体的外矩植体叹如胚评轴、雕茎段扫、子放叶、色幼叶挤等，飘其性绿质未厘定细挺胞的鄙部位谷及数东量分漆布是蚂不同亿的，委如叶帖尖部自分生公细胞巡少，么叶基挽分生请细胞皮多，犹子叶晚基部孕有大感量的绩分生短细胞泻，胚砖轴的澡极端板也有判大量问的分岔生细羞胞，离有的距外植采体的绝分生根细胞非埋藏常于深怕层，如尽管湖这些免细胞胁具有烘强的调再生醉能力去，但脑是农住杆菌忍难以冤深入御到附叹着于害这些同细胞木壁上车实现壳转化燕。购5浑、外那植体殿的预盲培养黑、接旨种及满与农冶杆菌昨的共害培养犁〔句1作〕外仿植体闪的预词培养耐预培盆养的筐作用品：〔猎1罩〕促宏进细形胞分输裂，甘分裂像状态堵的细藏胞更阿容易境整合驳外源崭DN号A剪因而滑提高肚外源渔基因患的瞬肺时表窗达和丝转化勺率。糟〔柔2家〕田窗间取翠材的掀外植确体通趣过预室培养侍起到朝驯化远作用谱，使压外植舍体适厕应于页试管闹离体字培养炮条件申，并马保持仁活泼黑的生微长代扰谢状形态。层〔沸3氏〕减关少外伶植体滴转化番过程届中的逗杂菌扯污染买率；怀如果督外植饼体上念带污膏染源非时，将在预薪培养霉被筛币选掉载。传〔隐4载〕有兰利于尺侵染焰接种怖的外同植体歇能与介培养村基平姨整接阿触。茂因为冒外植假体在社开始产培养粮过程各中，槽由于信其迅酱速生燕长而究出现根上翘境或卷织曲，江使农继杆菌辣的接挑种切绳面离唤开培兽养基阀致使殿农杆勇菌不动能生做长实虑现转恼化。蹲外植匆体的龟预培畜养时愚间：英每一哲种外村植体键均有童其最盏佳预中培养盼时间纷。预婚培养这时间观太长捆降低咏外植服体的过转化票率，叔甚至暂农杆搁菌侵斗染后寸外植帽体死竞亡。翁一般予以甘2共－妇3诊d尼为直党，例弦如矮弓牵牛斩、番沸茄、术拟南匹芥菜哗叶片当转化公均需邻2d差预培独养。螺否需夫要预察培养苗，预西培养贤多长迎时间走，要疤根据跃不同番植物蜂、不惊同外泼植体恩而确捧定。仔〔脱2霞〕外齿植体拔的农坊杆菌赴接种荐外植匙体接财种就疮是把朴工程决菌接恳种到苍外植泻体的淘损伤杏切面皇。卵方法修是将梅切割胜成小班块的啦外植惭体浸幸泡在能制备幼好的那工程洋菌液沃中，英浸泡览一定导时间尾后，幕尚需煤用无倡激素手植物医培养怎基或颂无菌遣水漂温洗，曲再用止无菌缓吸水蚂纸吸治干。有但目迹前外墙值体狡用菌飘液浸乞泡后渔常不震经漂隶洗，细直接奇放在除无菌宏吸水陡纸上梯吸干址外植婶体非兵伤口暂面的匀菌液柏，即势可进舒行共鞋培养棚。块在接赛种过捎程中从应注讲意以阿下几升点：兵掌握欧外植俊体在括菌液赞中浸被泡的佛时间笼：有树助于丽减少勇后继笛培养应中可堡能造复成的劲污染肾，并锅可减燥轻细甚菌对出植物各细胞慢的毒衬害作趁用，惨一般别控制者在数宗秒钟甩至数己分钟锯内，幻以叶盼盘边妄缘充漂分湿马润为呼度。拢浸泡免时间敏太短嫌农杆悠菌尚围未接我种到猜伤口筛面，啄在其表培养蠢时无篇农杆翻菌生膏长，和不能妥转化项。如判果外阀植体赔在菌启液中漫浸泡澡时间躬太长齐，常咱因农筐杆菌指毒害乎缺氧养而软稀腐，努一般责不要蜓超过蜡30储ml径n秩。帮菌液残浓度肤：对耀不同愿植物模的外馒植体您而言谋有一赤定差帖异，俗一般盒浓度罚范围羡是赛O师D6责00榴=0殊．蔽05拘～揉0格．认7盛之间浆。对敬农杆拦菌敏妻感的讽植物凯，因挺其易圈产生山过敏狮反响辛而导谷致外量植体冠切口妙处褐溉化，稼故常幻采用南较低颤的档OD碰值和邀较短勿的浸忍泡时晶间。圈浸泡无后的萝外植巩体在催滤纸驱上吸如干要办适度落，如偿果暴嫂露时峰间太原长造默成外士植体翠失水穗萎回施；吸描得太画干在耳共培虽养时颂切口崇面无蜻农杆症菌生沟长。雾因此漫要明键确滤村纸吸阴干的斜原那么稻是除恩去过酱量的滩菌体雅。貌〔种3络〕农窝杆菌岗与外脑植体折共培充养丧接种练菌体脆后的锈外植昨体培分养在胜诱导金愈伤团组织岔或不欠定芽巩分化缩的固趋体培罢养基王上，跑在外惧植体辨细胞谅分裂蛾、生半长的饶同时叔，农丝杆菌物在外爱植体腾切口稻面也帽增殖摔生长棕，该父两者督共同挎培养沟过程抛称之景共培矛养。拐最正确餐共培闻养的舌时间宅：贿农杆侨菌转匙化时驼，并暗不运“医侵入坛〞交到植悉物细邪胞中筒去，拼而是剥把冶T孟－匆DN枝A宏转移侵到植椒物细哈胞。戚农杆锡菌附困着后加不能摩立即慈转化晴，只糟有在运创伤缝部位疤生存翅16牲h纱之后蹲的菌蹄株才浪能诱绒发肿厦瘤，需这一盾段时渗间称刚为朗“取细胞逼调节村期伴〞袍。因梁此，艰共培锐养时讯间必外须长授于副沿洁16堤h扎。共西培养堆时间哄太长快，由虾于农联杆菌相的过饺度生基长，绿植物田细胞偏因受纷到毒解害而获死亡受。共恭培养浸时间旅对转鹿化率颗有着稳很大弱影响堆，而防且不蠢同物钓种、聪外植脾体种堆类、旋农杆率菌菌这株的处最正确筑共培兄养时西间不猫同。顺确定术最正确睬共培吐养时欲间的仔方法晕主要雕采用玉gu娱s简基因碎瞬时方表达寇测定桂法，货即共棕培养转后定而时测架定外娃植体谱的橡gu布s伍基因通颜色零反响盲，统劳计瞬骗时表撑达率影及表诞达面遇积，喜以表扯达率皂高，跳表达拘面积庆大为筛优。否同时屠还要家考虑档外植剩体的炭受损博害程悬度，劣以保循证外不植体捕的旺遣盛生拍长为坐直。灿最后列还要王以获勿得的肝转化宗愈伤赤组织惩频率杯或转临化不桑定芽恒频率音为最没终依疯据。叶农杆秧菌的柏增殖差适度呆在共肆培养饮时农砖杆菌筋增殖谷生长亲不良外，外友植体挑切口错边缘妈只有亡很少蕉的农惹杆菌遇生长呜，那么逼转化狂的机节率很险小。淋反之飞，农脑杆菌傻在外仙值体赠四周斤过度估增殖授，可筒引起蛇对外脉植体涉的毒智害，滥致使忍其褐摔化死劈亡。闻控制件农杆浮菌增和殖适童度的驱原那么疼是既墓要使巩菌株狭在外容植体羊边缘锐特别窃是切福口面朝旺盛蚂增殖垮生长戴，又为不应惧过度月，一码般以启覆盖串切口熟面为依适度址。菠控制杰农杆侮菌增后殖的昆方法孤有以饭下几距种：栏邀1讽〕调串整工艘程菌挠液的赤浓度嘱，生如长太够快那么荡应降踏低菌恒液浓妖度。白捧2悦〕控享制共认培养悬时间瓶，农侵杆菌编的增蚕殖生辛长适奉度也只是确垒定共敬培养仍最正确送时间羊的指疲标，嗓共培成养时扔间太捡长可肤造成够农杆堪菌过蛙度生狸长。尘蜻3啦〕使三用抗臭生素粱调控番农杆蜓菌的期增殖楚生长悉。一反种方岩法是抖在共方培养史基中灯参加房适量烘的抗碰生素肥如羧汁苄青错霉素洪或头烫孢霉完素。房另一事种方型法是窑共培车养驻2俗～侵3d许后的逼外植肥体需霜用含林抗生把素的赔液体全共培跳养基科充分膏洗涤夸，以暑除去糖过量攻的农李杆菌哑，然惕后转赞到新意鲜的彩共培茎养基累上继令续共霞培养踩。共芝培养航结束糊时假设涝仍存畅在农悟杆菌次过度乒增殖欢，那么肝可再拢用上悦述洗杀涤培舱养基绵充分皮洗涤毒后进翅行愈航伤组旁织诱困导或扁不定毅芽分法化培沫养朋。售共培您养中穿激素店的影扭响鹊共培悄养时刘培养沟基中砍是否梯加激穴素，是文献自报道稿不一蝴，有猾的不涨加激谁素，蚀有的疮那么认脊为加衡激素杀后促略进外标植体迈细胞额分裂麻，保阻持细喝胞活歌力，挽也有熄利于敬转化裁后细秩胞的券生长虹，从待而提耕高转暗化率喷。卫如板M抗an削su面r秘等〔程19润93挽〕用艇A渡28勿1国菌株伏与花清生叶除片外滑植体漏共培史养时危，加守激素券比不奸加激眯素的幸肿瘤筹诱导开率提土高约串拘30素％。权目前偏大多早数研肚究者浇采用申加激雁素的堤方法届，而相且共僵培养忙基与饿愈伤笑组织赠诱导酸或不贫定芽微诱导弃培养纸基相姨同。沾〔军4逐〕外深植体混脱菌天及选铅择培释养楚外植哪体的搬脱菌详培养突脱菌伍培养粱，即顺把共邮培养泊外植流体转钢移到愚含有合抗生晚素的殊培养舍基上岁。常梁用的饥脱菌样抗生霉素有狱羧苄循青霉骂素〔库Ca鼻rb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