酶免疫试验专题知识讲座

放射免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术掌握：酶联免疫吸附试验；熟悉：酶和酶作用底物、固相载体、酶免疫测定的应用；了解：酶标记抗体或抗原、酶免疫技术的分类；第一节酶免疫试验的组成要素第二节酶免疫试验的分类第三节酶联免疫吸附试验第四节酶联免疫斑点试验第五节发光酶免疫试验第六节酶免疫试验的临床应用及常用商品试剂的方法特点第七节影响酶免疫试验的主要因素酶免疫试验(enzymeimmunoassay,EIA)

以酶标记抗体（抗原）作为主要试剂，将酶高效催化反应的专一性和抗原抗体反应的特异性相结合的免疫检测技术。

酶免疫测定技术酶免疫组织化学技术抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性原理及特点原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析原理及特点原理及特点特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。第一节

酶免疫试验的组成要素固相抗体或抗原是非均相酶免疫技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法

固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面

一、固相载体要求

结合抗体或抗原的容量大抗体或抗原牢固地固定在其表面不影响免疫反应性利于反应充分进行固相方法简便易行，快速经济种类微孔板磁微粒膜载体固相载体将抗原或抗体结合于固相载体（直接包被、间接包被）用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附包被coating封闭blocking二、包被抗原或抗体直接包被稀释抗原或抗体（用0.05mol/LPH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原或抗体到3-10µg/mL）4°c过夜封闭（牛血清白蛋白或小牛血清）间接包被亲和素-生物素化抗体（抗原）SPA-抗体（抗原）间接吸附于固相载体上1.辣根过氧化物酶（HRP）2.碱性磷酸酶（ALP)3.β-半乳糖苷酶

(β-Gal)

三、酶结合物HRP的常见底物

邻苯二胺(OPD)四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸(5-ASA)2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS)常用底物四、酶的显色底物与酶促发光底物OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色

，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。

HRP的常见底物

酶和酶作用底物ALP底物

β-Gal的底物

对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。常用底物酶和酶作用底物

第二节酶免疫试验的分类酶免疫试验酶免疫组化酶免疫测定技术均相：不需要分离异相固相酶免疫试验液相酶免疫试验组织切片或其它标本中抗原的定位

液体标本中抗原或抗体的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定

酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理一、均相酶免疫试验最具代表性的两种技术：酶放大免疫分析技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供体免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫测定酶放大免疫分析技术EMIT示意图常用酶：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和溶菌酶酶放大免疫分析技术EMIT示意图克隆酶供体免疫分析（CEDIA）示意图与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物二、异相酶免疫试验分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定1关于均相酶免疫测定，下列哪项正确（）A多用于大分子物质的测定B酶标抗原和抗体在固相载体表面形成复合物，作用于底物显色C需要分离结合和游离酶标记物D常利用酶标记抗原与抗体结合后的空间位阻降低酶活性E酶标抗原与待测抗原竞争结合抗体，故最终酶活力的大小与标本中抗原量负相关第二节习题2酶免疫技术是根据何种特性分为均相和异相的（）A抗原特性B抗体特性C抗原抗体反应后是否需要分离结合和游离酶标记物D酶的稳定性E载体特性第三节酶联免疫吸附试验底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体12洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离34一、基本原理二、ELISA方法建立的基本步骤（一）ELISA方法类型的建立1初步确定方法类型2.工作条件的优化3.ELISA检测结果测定（二）对建立的方法进行评价固相的抗原或抗体

酶标记物（酶结合物）

酶反应的底物

三个必要试剂三、方法类型及反应原理

elisa试验.exe方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗原的方法1、已知抗体包被于载体表面3、加酶标抗体与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包被于载体表面2、加待检物无抗原与抗体结合3、加酶标抗体无抗原结合YYYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYYEY+-竞争法

方法：用已知抗体包被，同时加入待测血清和酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）ELISA检测抗原的方法洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYEYYEYYYYYE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合YEYYEYEYEYE

elisa间接法阳性.exe方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用常测定HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等ELISA检测抗体的方法1、已知抗原吸附于载体表面2、加待检物无抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig与抗体结合4、加酶作用的底物产生颜色1、已知抗体吸附于载体表面2、加待检物有抗体与抗原结合3、加酶标的抗Ig抗体4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+

双抗原夹心.exe原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似应用：乙型肝炎表面抗体ELISA检测抗体的方法ELISA检测抗体的方法竞争法原理：类似检测抗原的竞争法应用：HBcAb和HBeAb的检测竞争法非经典竞争法非经典竞争法捕获法应用：

病原体急性感染诊断中的IgM型抗体甲型肝炎HAV-IgM抗体乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体ELISA检测抗体的方法捕获法

原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色

洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色1下列哪一种ELISA最常用于抗原的测定（）A双抗体夹心法ELISAB间接法ELISA

C竞争法ELISAD捕获法ELISAE补体结合法2捕获法主要用于何种物质的测定（）AIgGBIgACIgMDIgDEIgE

第三节习题3下列关于双抗体夹心法原理，不正确的是（）A使用分别针对抗原不同决定簇的两种单克隆抗体作为酶标记物B一种单克隆抗体作为固相抗体，另一种作为酶标抗体

C可使标本和酶标抗体同时加入成为一步法D用于检测二价或二价以上的抗原E采用高亲和力的单克隆抗体可提高检测的灵敏度和特异性4下列何种方法用一种标记物可检测多种被测物（）AELISA双抗体夹心法BELISA竞争法C放射免疫法DELISA捕获法EELISA间接法5关于ELISA竞争法，下列叙述正确的是（）A用于检测抗原B被测物与酶标记物的免疫活性各不相同C被测物多则标记物被结合的机会少D待测管的颜色比对照管的浅则表示被测物量少E结合于固相的酶标记抗原量与被测抗原量成正比第四节

酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot)

包被有待测细胞因子抗体的微孔板

分泌相应细胞因子的待测细胞

有或无刺激物培养细胞因子被板上的特异性抗体捕获后续的反应如同ELISA

一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关

基本原理+酶联免疫斑点试验(ELISPOT)

第五节

发光酶免疫试验（LEIA）原理：参与催化某一发光反应的酶来标记抗体（或抗原），在抗原-抗体反应后加入发光物，酶催化和分解底物发光，由光检测仪检测发光强度，最后通过标准曲线计算出被测物的含量。化学发光酶免疫试验荧光酶免疫试验

荧光酶免疫试验

第六节酶免疫试验的临床应用及常用商品试剂的方法特点（一）均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。（二）异相酶免疫ELISA用于临床血液及其他体液标志物ELISPOT监测HIV等疫苗研究免疫应答反应、移植研究、Th0/Th1/Th2细胞转换分析、自身免疫研究、过敏机制探讨、传染性疾病研究。（三）发光酶免疫试验用于微量物质的定量检测.

第七节影响酶免疫试验的主要因素一、试剂盒原材料因素二、标本因素三、实验室环境因素四、操作因素抗原要求纯度高，抗原性完整

抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。

抗原抗体选择1．酶免疫技术的要点？2．酶联免疫吸附试验的原理?3．常用的底物有哪几类？特点？4．常用的酶有哪几类？特点？思考题酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，异相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。小结标记酶的要求：

1.纯度高,活性强,催化反应效率高。

2.易与抗体或抗原结合标记后酶活性稳定，不影响抗原抗体反应性。

3.作用专一，且酶活性不受样品其他成分影响。

标记酶的要求：

4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法敏感，重复性好，简单易行。

5.酶、辅助因子及其底物对人体和环境无害，易于配制、保存，价廉易得。

辣根过氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要

ELISA中应用最为广泛的标记用酶

常用酶酶和酶作用底物碱性磷酸酶（AP）

菌源性AP肠黏膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫测定

常用酶酶和酶作用底物HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种

H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高

常用底物酶和酶作用底物HRP的常见底物

邻苯二胺(OPD)四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸(5-ASA)2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS)常用底物酶和酶作用底物OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝