噬菌体展示技术的原理及其应用

Phagedisplay

LiuYun

——基于将某个蛋白与其遗传信息之间直接联系的筛选方法1

噬菌体展示技术（PhageDisplaytechniques，PDT）起源于1985年，是一种用于筛选和改造功能性多肽、蛋白质强有力的生物技术，广泛应用于蛋白组学、基因克隆等多个分子生物学领域。概述

目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响。2SmithGP.Filamentousfusionphage:novelexpressionvectorsthatdisplayclonedantigensonthevirionsurface.Science,1985,228:1315-1317.

1985年Smith首次通过基因工程的手段，将外源基因插入丝状噬菌体基因组中，从而使表达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面，由此建立了噬菌体展示技术。1990年Scott等首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋白g融合展示在噬菌体表面，建立了噬菌体展示随机肽库。ScottJK,SmithGP.Searchingforpeptideligandswithanepitopelibrary.Science,1990,249:386.3

噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。

基本原理4特点

该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。5PhagesFilamentousphagesM13FdF1OthersT4λ6FilamentousphagesInfectmanygram-negativebacteriaCircularsinglestrandedDNAgenomeAbout6.4kb.p.Long,flexibletubestructureabout1µmlongand6.5nmindiameterReproducedandsecretedfrominfectedbacteriawithoutcellkillingorlysis(lysogenicphage)7(a)Adenovirus.(b)Rotavirus.(c)Influenzavirus(courtesyofGeorgeLeser).(d)Vesicularstomatitisvirus.(e)Tobaccomosaicvirus.(f)Alfalfamosaicvirus.(g)T4bacteriophage.(h)M13bacteriophage.M13噬菌体颗粒结构8M13噬菌体的生活史其裂解周期为：1)吸附(adsorption)2)侵入(entory)3)复制（生物合成biosynthesis）4)成熟(maturation)5)装配(assembly)6)释放(release)9丝状噬菌体的基因及蛋白结构http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1415-47572005000100001&script=sci_arttext

pIII(406aa,5~8copies)pVIII(50aa,~2700copies)pVI(112aa,5~8copies)10载体的插入位点

11pIII和pVIII噬菌体展示系统pIII系统pVIII系统拷贝数少多多肽片段大小大<10个氨基酸亲和力高低适用范围常用于展示由cDNA和基因组序列编码的多肽，范围较广展示小肽，范围较窄12UsedforcloningforeigngenesamongotherapplicationsProteinsandpeptidesarefusedtotheCapsid(surface)ofthephageThecombinationofthephageandpeptideisknownasaFusionProtein实验设计思路13选择方法：淘选（Panning)而不是筛选（Screening)14非展示系统展示系统15固相淘选麦系统完整松细胞组织更，器晶官常规律法淘选侮方法正负觉法竞争院法16T7雹噬菌简体展春示筛危选系妥统测序分析插入序列将噬菌体文库铺在固定的靶蛋白上洗脱未结合的噬菌体加入大肠杆菌，扩增和富集洗脱的噬菌体铺富集文库铺盘分离单个克隆3~4轮筛选验证实验：结合实验实验呀流程17So剃li视d微ph零as危e跃se肝le狐ct据io救n陈wi疑th畜i住mm津un寻ot取ub搬esvIm肯mu极no毯tu农beco杂at仿ed意w唱it懒han茫ti为ge艘nco覆at滴ed疏w载it牧hst避ep与ta弄vi太di浇n旦an怨dbi疼ot遵in亚yl援at址ed候a作nt辰ig忌enBBBBBBBv18Bi刷nd肠t矿o坡St糊re爱pt印av祸id魂inco怒at文ed习m宿ic疤ro亩ti想tr说e召we颤ll吐s19Wa尘sh利t第o沈re瓶mo秆ve演u庙nb绕ou颂nd懂p疤ha年ge独p域ar四ti贪cl什es20El彼ut晨e个bo苏un定d融ph镜ag奖e21Am足pl娇if步y施el德ut呢ed谣p糟ha敌geRe西pe魂at妇s清el头ec阅ti禾onAn告al疑yz惹ea)眠E夸LI妖SAb)撕S剩pe幸ci基fi崖ci煎tyc)撞S浩eq午ue脆nc钉in降gd)借A队ff达in吐it堵ye)评A伍ct蝴iv铜it赚yE.捆co镇li感染和扩挠增22举哀例呼吸勒道合周胞病甜毒感疫染呼竖吸道候上皮签细胞眯靶向他肽的叙筛选挪及验喉证23242526272829噬菌稳体展固示系辣统的铁应用嫩及优那缺点应用显范围30受体—配体南信壮息传虽递蛋白支质—蛋白卧质拮抗锯剂蛋白编质—D傅NA抑制休剂蛋白绵质—其他多肽诊断基因总表达拼控制中和距活力药物传及药驳物导耐航酶及哑底物31优点跨：A.产高昼通量律的淘蹦选：将靶罚标分川子（暖抗体掉）固踩定在锤固相旺载体俯上，浆加入油噬菌革体展捷示肽腔库（莲噬菌旨体的忆数量捐可达待1011PF院U）泰，利孟用抗域原-呜抗体先的特批异性欺亲和提力将牛与抗洋体结侵合的雪噬菌忠体吸围附在讽固相蛛载体蚁上，货反复执数轮诉扩增涉、淘辩选，屿即可捞将有帆用的痕基因翻从多泥达百室万以滚上的茂噬菌拣体克展隆中凶分离布出来章。B.念高涌效率团：在极驾低的闷存在蛙水平营下，处挑选设到高收亲和纤力噬俩菌体狂成为舞可能择。C.平可糠用于迫模拟葵表位猫的筛芹选：利用再噬菌垂体展妖示技饿术得倦到模协拟表效位，于同样拘可诱膜发与狭天然买表位素相似猫的特医异性筑免疫锯反应耻。D.辜展示泡的多诉肽或算蛋白典质与谨其包缺含在订噬菌旁体内挖部的蔽基因吃密码罢的连渐接:使得萝结合亦肽或叔蛋白译质的戚序列顿分析蛋既快走速又袄简便刻。E.易于胜纯化重组浊噬菌甚体的胀纯化菠步骤渴简单智、不幻玉要求块昂贵潜的试乳剂与拾设备倍，在赔一般里的实猪验室苗条件除下就感可以树完成行。32缺