仪器分析-紫外-可见分光光度法

仪器分析-紫外—可见分光光度法..第一页，共123页。学习内容

（第6～9周）紫外-可见分光光度法（第3章）分子发光分析法（第5章）红外光谱法（第4章）分子?光谱第二页，共123页。第3章紫外-可见分光光度法

ultravioletandvisiblespectrophotometry

（UV-Vis）

3.1

紫外-可见吸收光谱3.2

光的吸收定律3.3

紫外-可见分光光度计3.4

分析条件的选择3.5

紫外-可见吸收光谱法的应用第三页，共123页。基本概念spectrum：复色光被色散系统分光后按照波长或频率的大小依次排列的图像。

spectrum第四页，共123页。spectroscopicanalysis：利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法。(是以光与物质的相互作用为基础建立起来的仪器分析方法。)基本概念250500第五页，共123页。基本概念

UV-Vis：利用某些物质分子对200～800nm

光谱区域内辐射能的吸收来研究物质的性质、结构和含量的方法。UV-Vis主要反映共轭体系和芳香族化合物的结构特征。第六页，共123页。3.1紫外-可见吸收光谱(基本原理)500250邻甲苯胺紫外-可见吸收光谱图第七页，共123页。3.1紫外-可见吸收光谱光的基本性质；物质对光的选择性吸收；分子吸收光谱的形成；有机化合物的紫外-可见光谱；无机化合物的紫外-可见光谱；紫外-可见光谱中的常用术语；影响紫外-可见吸收光谱的因素第八页，共123页。光的基本性质光是一种电磁波，具有波粒二象性。

E＝hυ

υ＝c/λ

波长越长，光量子能量越小，反之能量越大。E=hc/λ第九页，共123页。举例：白光硫酸铜溶液？色的光被吸收呈蓝色互补色光：如果两种颜色的光按一定比例混合后可成为白色光，这两种光称互补色光。（黄色）

物质对光的选择性吸收第十页，共123页。/nm

颜色

互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿第十一页，共123页。物质对光的选择性吸收是物质与辐射能相互作用的一种形式。只有当入射光的能量（Eλ）与吸光物质分子从基态跃迁到某一激发态所需能量（△E）相等时才会被吸收。第十二页，共123页。

激发态

E1

E=Eλ

基态

E0跃迁几率越大，物质的摩尔吸光系数越大。第十三页，共123页。3.1.1紫外-可见分子吸收光谱的形成

UV-Vis是分子吸收光谱，它的产生可以看做是分子对紫外-可见光光子选择性俘获的过程，本质上是分子内价电子跃迁的结果。第十四页，共123页。

分子的价电子在吸收电磁辐射并跃迁到高能级后所产生的吸收光谱，通常被称为电子光谱，由于其波长范围是在光谱的紫外和可见区，所以电子光谱又叫紫外/可见光谱。紫外可见光谱的产生第十五页，共123页。3.1.1紫外-可见分子吸收光谱的形成

分子内部运动价电子运动Ee核的振动Ev分子绕其重心的转动Er△E=△Ee+△Ev+△Er△Ee>△Ev>

△Er第十六页，共123页。带状光谱线光谱第十七页，共123页。化合物的紫外-可见光谱决定于分子的结构和分子轨道上电子的性质。300400500600700/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350第十八页，共123页。化合物分子的特征吸收波长（λmax）决定于分子的激发态与基态之间的能量差。第十九页，共123页。3.1.2有机化合物的紫外-可见吸收光谱

O：nCπHH

σ

σ*

>π*

>n>

π>σ与紫外-可见吸收光谱产生有关的电子：第二十页，共123页。有机化合物分子内电子跃迁类型σ

σ*

nσ*

n

π*

ππ*

分子的电子能级跃迁σ*π*nπσ

E第二十一页，共123页。3.1.2有机化合物的紫外-可见吸收光谱（1）σ

σ*跃迁：发生在远紫外区，实际应用价值不大。例：甲烷λmax125nm.（2）nσ*跃迁：含有未共享电子对的取代基都可能发生这一跃迁，所需能量取决于n电子所属原子的性质。例：碘甲烷λmax259nm.1.饱和有机化合物第二十二页，共123页。3.1.2有机化合物的紫外-可见吸收光谱

ππ*

跃迁可发生在任何具有不饱和键的

有机化合物分子中。特征是ε较大，为强吸收（K带，共轭作用得名）。

n

π*

跃迁发生在含有杂原子双键的不饱和有机化合物中，吸收强度弱（R带，杂原子不饱和基团得名）。2.

不饱和脂肪族化合物第二十三页，共123页。3.1.2有机化合物的紫外-可见吸收光谱3.芳香族化合物E1和E2是由苯环中的ππ*

跃迁产生，B带由苯得名，是芳香族化合物特征吸收带。第二十四页，共123页。3.1.3无机化合物的紫外-可见光谱1.电荷转移光谱

电荷转移光谱：某些无机配合物和有机物可产生此类光谱,实质是分子内氧化还原过程；其特点是摩尔吸光系数大(>104)，用于定量分析可获得较高的检测灵敏度。第二十五页，共123页。3.1.3无机化合物的紫外-可见光谱2.配位体场吸收光谱

ε＜102,位于可见光区，较少用于定量分析，可用于研究配合物的结构及无机配合物键合理论。第二十六页，共123页。第二十七页，共123页。3.1.4紫外-可见光谱中的常用术语（P25自学）吸收峰谷肩峰末端吸收吸收峰第二十八页，共123页。

是指分子中产生吸收带的主要官能团；吸收带的λmax＞210nm,属于π→π*

、n→π*等跃迁类型。

生色团为不饱和基团：C=C、N=N-、C=O、C=S、-NO2等；生色团吸收带的位置受相邻取代基或溶剂效应的影响，吸收峰向长波或短波移动。生色团(chromophore)第二十九页，共123页。助色团(auxochrome)是指分子中一些带有非成键电子的杂原子饱和基团,本身在紫外-可见光区不产生吸收，但是当它与生色团连接后，使生色团的吸收带向长波移动，且吸收强度增强。-OH、-OR、-NH2、-SH、-Cl、-Br、-I等第三十页，共123页。

溶剂效应体系pH的影响

3.1.5影响紫外-可见光谱的因素共轭效应立体化学效应分子结构分析条件核心是对分子中电子共轭结构的影响UV-Vis主要反映共轭体系和芳香族化合物的结构特征第三十一页，共123页。3.1.5影响紫外-可见光谱的因素1.共轭效应：共轭的π电子在整个共轭体系内流动，属于共轭基链上全部原子所有，所以它们受到的束缚力较小，只要受到能量较低的辐射即可被激发。共轭体系越长，最大吸收波长越向长波方向移动，吸收强度也增强。第三十二页，共123页。3.1.5影响紫外-可见光谱的因素2.立体化学效应空间位阻跨环效应第三十三页，共123页。3.1.5影响紫外-可见光谱的因素物质以气态存在时的吸收光谱精细结构；物质在极性溶剂中的吸收光谱溶剂化。3.

溶剂效应溶剂对吸收峰的位置、强度及光谱形状均有影响第三十四页，共123页。溶剂效应

（1）溶剂极性对ππ*跃迁的影响

π*

π*

π

能量E非

E极π水>甲醇>乙醇>丙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>氯仿>二氯甲烷>苯>四氯化碳>己烷>石油醚第三十五页，共123页。溶剂效应（2）溶剂极性对n

π*跃迁的影响能量π*n

E非π*nE极第三十六页，共123页。（a）苯酚的UV光谱图（b）苯胺的UV光谱图

4.

体系pH值对吸收带的影响第三十七页，共123页。小结：

UV-Vis涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区域在200～800nm；有机、无机化合物紫外-可见光区电子跃迁的类型；影响紫外-可见吸收光谱的因素。UV-Vis法是分子光谱分析法，利用的是分子对外来辐射的吸收特性；第三十八页，共123页。课后练习1.何为生色团、助色团？2.紫外吸收光谱法中，极性溶剂为什么会使ππ*跃迁的吸收峰长移，却使ｎπ*跃迁的吸收峰短移？3.课后题1、2（P50）第三十九页，共123页。本节参考书

1.《分析化学》，人民卫生出版社，参考“紫外-可见分光光度法的基本原理和概念”的相关内容。2.《仪器分析》，复旦大学出版社，参考第二章“紫外-可见吸收光谱法”的相关内容。

3.《无机化学》，高等教育出版社，参考“化学键与分子结构”的内容。第四十页，共123页。复习紫外-可见吸收光谱的形成；有机物、无机物的紫外-可见吸收光谱；影响紫外-可见吸收光谱的因素本次课内容3.2Lambert-Beer’s

Law3.3

紫外-可见分光光度计第四十一页，共123页。3.2Lambert-Beer’sLaw

（分光光度法定量分析的基础）选定波长的入射光待测溶液

A？c被测组分的含量透射光T第四十二页，共123页。3.2.13.2.2T,A,Lambert-Beer’sLaw

IrI0ItIa

I0=Ia+It+Ir

(1)第四十三页，共123页。3.2.13.2.2T,A,Lambert-Beer’sLawI0=Ia+It+Ir

（1）

I0=Ia+It

（2）

T=

It/I0

（3）A=-lgT

（4）如果在多组分溶液中，各组分间不存在相互作用，测得的吸光度具有加和性。这一性质是分光光度法测定混合组分的依据。第四十四页，共123页。3.2.13.2.2T,A,Lambert-Beer’sLawLambert定律描述了A与l的关系A=k´lBeer定律描述了A与c的关系A=k″c

实验证明，溶液对光的吸收程度(A)与c、l、λ有关。第四十五页，共123页。Lambert-Beer’sLaw

当入射光波长一定时，溶液对光的吸收程度只与溶液浓度和液层厚度有关。

A=kcl=-lgT=lgI0/It

(5)上式说明T与c,l

之间是指数函数的关系，当c增加一倍时，T降至T2；而A与c,l

之间是简单的正比关系。第四十六页，共123页。3.2.3吸光系数-k摩尔吸光系数吸光系数百分吸光系数K值物理意义：数值上等于吸光物质在单位浓度和单位厚度时的吸光度值。在给定波长、溶剂和温度等条件下，K是物质特征常数，表明物质对某一特定波长光的吸收能力。ε1ε2第四十七页，共123页。摩尔吸光系数（ε）

当l以cm

表示，c以mol/L表示时，k值称为摩尔吸光系数，用ε表示。单位是L·mol-1·cm-1

。A=εlc第四十八页，共123页。摩尔吸光系数与灵敏度ε是吸光物质分子的一个特征常数，可作为估量定量分析方法灵敏度的指标。ε越大，改变浓度而引起的吸光度的改变就越显著，测定的灵敏度也就越高。提高摩尔吸光系数的方法分子结构测量条件第四十九页，共123页。吸光系数（a）

当c以g/L

表示时，k

值称吸光系数，单位是：L·g-1·cm–1

。A=alc

A1cm1%

(百分吸光系数)

一种吸光物质的百分浓度为1%（g/100ml）的溶液在1cm吸收池中的吸光度。

A=a1cm

1%

lca1cm

1%=10a=10ε/M（6）第五十页，共123页。例题用紫外-可见分光光度法测定Fe，有下述两种方法。A法：a=1.97X102L•g-1•cｍ-1;B法:ε=4.10X103L•mol•cｍ-1.问：何种方法灵敏度高？第五十一页，共123页。3.2.4偏离Lambert-BeerLaw的因素偏离Lambert-BeerLaw

的因素主要与样品（化学因素）和仪器（光学因素）有关。

A=kcl第五十二页，共123页。1.与测定样品溶液有关的因素A=klc当c不变时

A与l之间的线性关系普遍存在A=klc当l不变时c

>0.01M

时,A与c的线性关系会发生偏差。吸收定律是一个有限的定律(1)浓度第五十三页，共123页。为什么在

c>0.01M时,A与c的线性关系会发生偏差？当c>0.01M

时当c≤0.01M

时比尔定律在低浓度时正确，高浓度时受限。1.邻近质点彼此电荷分布2.各组分之间的相互作用分子间的相互作用可忽略不计第五十四页，共123页。(2)溶剂

由于待测物与溶剂发生缔合、离解及溶剂化反应，产生的生成物与待测物具有不同的吸收光谱，出现化学偏离。(3)光散射的影响当试样是胶体或有悬浮物时，入射光通过溶液后，有一部分光因散射而损失，使吸光度增大，对BeerLaw

产生正偏差。第五十五页，共123页。

2.与仪器有关的因素Lambert-BeerLaw只适用于单色光。单色光：是由单色器从连续光谱中分离出的一小段波长范围的复合光，不是绝对的单色光，有可能造成对比尔定律的偏移。谱带宽度（bandwidth）：指具有某一波长范围的光谱带，常用半峰宽来表示。第五十六页，共123页。谱带宽度对吸收定律的影响

相同谱带宽度的情况下，选择哪一个谱带宽度（波长）作为测定波长？

实验证明：选用一束吸光度随波长变化不大的复合光作为入射光进行测定（吸光物质最大吸收波长）。由于在此范围内，吸光物质的吸光系数变化不大，对比尔定律造成的偏离较小，并能保证测定有较高的灵敏度。第五十七页，共123页。谱带宽度对吸收定律的影响

图示：AλAc谱带A谱带B谱带A谱带B∆A1∆A2第五十八页，共123页。3.3紫外-可见分光光度计

UV-Visspectrophotometer3.3.1

仪器主要部件及作用3.3.2常用分光光度计类型及功能简介3.3.3分光光度计的校正第五十九页，共123页。3.3.1主要部件及作用0.575光源单色器吸收池检测器显示第六十页，共123页。3.3.2分光光度计类型简介1.单波长分光光度计单光束分光光度计双光束分光光度计2.

双波长分光光度计第六十一页，共123页。1.单波长分光光度计

单光束分光光度计特点：只有一条光束第六十二页，共123页。单光束分光光度计

不足：要求光源和检测系统必须要有较高的稳定性；每更换一个测定波长，都要用空白溶液重新校准。

实验：芦丁含量测定；差示法测定样品中高含量镍。752型紫外-可见分光光度计第六十三页，共123页。

单波长双光束分光光度计特点：在同一台仪器中使用两个完全相同的光束。第六十四页，共123页。双光束分光光度计优点：可自动扫描样品溶液吸收光谱；消除光源强度不稳引入的误差；仪器开机后无须预热可直接测样；能减小放大器增益的漂移。

岛津UV3101型吸光度测定光谱扫描时间光谱扫描功能第六十五页，共123页。双波长分光光度计

特点：

可将两种不同波长的光交替通过同一样品

溶液，得到这两个波长下的吸光信号，再通过适当的信号转换系统转换为它们之间的吸光度差A。

A=Aλ1–Aλ2

第六十六页，共123页。双波长分光光度计

优点：不需要参比溶液；能够减少背景吸收和干扰吸收以及光源电压变化产生的影响；可用于相互有干扰的多组分混合物的分析。岛津UV300型第六十七页，共123页。3.3.3分光光度计的校正波长校正：检查仪器的波长刻度与实际波长是否能较好的保持一致。用镨钕玻璃或钬玻璃第六十八页，共123页。3.3.3分光光度计的校正吸光度校正：在实际工作中，有时需对仪器的吸光度标度进行检查和校正。用K2CrO4标准溶液吸收池校正：在吸收池A内装入试样溶液，B内装入参比溶液，测吸光度；洗净、调换两种溶液，再测吸光度。前后两次测得吸光度差值应小于1%。第六十九页，共123页。临床检验常用分子光谱仪酶标仪、全自动生化分析仪、尿液分析仪、血红蛋白测定仪：专用分光光度计，工作原理均遵循朗伯-比尔定律，采用比色法进行分析，仪器的核心都有一个“分光光度计”。知识拓展第七十页，共123页。酶标仪是一台变相的专用分光光度计；是酶联免疫吸附实验专用仪器；利用比色法来分析抗原或抗体的含量。如：血清中乙肝病毒表面抗原、抗体的检测。第七十一页，共123页。全自动生化分析仪主要采用比色法进行分析，工作波长在340～800nm之间；通过对人体血液中脂类、酶类、蛋白质、胆红素等的分析来测定各种生化指标；是临床最常用的检验仪器之一。第七十二页，共123页。尿液分析仪是检测尿液中某些化学成分（尿蛋白、葡萄糖、胆红素等）含量的专用自动化仪器；是反射光比色计，采用球面积分仪接受双波长反射光，检测试纸带颜色变化进行定量分析。第七十三页，共123页。血红蛋白测定仪用光电器件测透射光强度，并与已定标的血色素值相比较，即可得出血红蛋白含量；本质是一台专用比色计。第七十四页，共123页。小结Lambert-Beer’sLaw的数学表达式，吸光系数，偏离定律的因素；紫外-可见分光光度计各类型仪器特点。习题：课后3、5、9、15（P50）第七十五页，共123页。本节课参考书1.《仪器分析》复旦大学出版社2.《最新仪器分析技术全书》化学工业出版社3.《分析化学》人民卫生出版社4.《全国临床检验操作规程》东南大学出版社第七十六页，共123页。复习Lambert-Beer’sLaw，吸光系数，偏离定律的因素；紫外-可见分光光度计的主要部件，主要类型。本次课内容3.4分析条件的选择

3.5

紫外-可见吸收光谱的应用第七十七页，共123页。3.4分析条件的选择

3.4.1

仪器测量条件的选择3.4.2反应条件的选择3.4.3参比溶液的选择3.4.4干扰及消除方法第七十八页，共123页。

3.4分析条件的选择提高方法的灵敏度、准确度仪器测量条件试样反应条件参比溶液干扰及消除第七十九页，共123页。3.4.1

仪器测量条件

入射光波长的选择杂散光的影响透光率读数的影响（选择合适的吸光度范围）第八十页，共123页。入射光波长的选择应用“最大吸收原则”，在此波长（λmax）下测定，吸光系数大，灵敏度高。当最大吸收峰峰形比较尖锐时，可选吸收稍低、峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。当有干扰物存在时，可根据“吸收尽可能大，干扰尽可能小的原则”选择入射光波长。第八十一页，共123页。杂散光的影响

设杂散光强度为Is

,测得吸光度为：

A测=lgI0+IsIt+IsIt<I0，I0+IsIt+Is<I0/It即A测<

A，令Is/I0=

S,有：Is=S·I0杂散光：指仪器内部通过非预定途径照射到检测器上的额外的光辐射。第八十二页，共123页。杂散光的影响A测

=lgI0+S·I0It·I0/I0+S·I0=lg1+ST+S例：当S=1.0%,T=10%，求A测？

当

S=0,T=10%，求A？当S小于0.01%，可忽略杂散光的影响。第八十三页，共123页。任何分光光度计都有一定的测量误差。（这一误差来源于光源、检测器、显示系统）这一测量误差的总和最终表现在透光率读数T上，设为∆T。

透光率读数的影响第八十四页，共123页。

对同一台仪器来说，∆T是一常数。但由于A=-lgT，所以在不同的透光率读数范围内，同样大小的∆T所引起的吸光度误差∆A是不同的。

透光率读数的影响第八十五页，共123页。

根据朗伯-比尔定律：A与c成正比关系

因此，∆A与∆c也成正比关系。

∆A=K·∆c

（∆T、∆A、∆c均为绝对误差）

测量结果的误差通常用相对误差来表示：

∆c/c透光率读数的影响第八十六页，共123页。∆c/c与A、T的关系

A=-lgT=εlc（1）

(-0.434/T)dT=εldc（2）

将（2）式代入朗伯-比尔定律，整理后得：

0.434

（3）TlgT

∆c/c=

∆T

第八十七页，共123页。∆c/c与T的关系∆c/c

36.8%

T

∆c/c=0.434

TlgT

∆T0.434Amin第八十八页，共123页。结论1.

∆c/c

取决于透光率T和透光率测量误差∆T的大小;当T=36.8%时(或A=0.434)，∆c/c最小。2.当T读数在70%～10%,即A

读数0.15～1.0

范围时,

∆c/c

较小(<5%)，并且变化不大。第八十九页，共123页。3.4.2反应条件的选择显色反应：使待测物与显色剂作用，生成有颜色的化合物，颜色深浅与待测物浓度相关，在一定范围内呈直线关系。目的：使被测组分在所选择反应条件下能有效地转变为适于吸光度测定的化合物形态。第九十页，共123页。显色反应需满足以下要求反应有较高的选择性，生成物在紫外-可见光区有较强吸光能力。生成物组成恒定、稳定性好，与被测物之间必须有确定的定量关系，显色条件易于控制。对照性要好，显色剂与生成物的最大吸收波长差别要在60nm以上。第九十一页，共123页。反应条件的选择（影响显色反应的因素）

显色反应：M+nRMRn

1.显色剂用量：作吸光度随显色剂浓度变化曲线，选恒定吸光度值时的显色剂用量。

2.同时还需考虑显色反应的灵敏度、稳定性和反应的选择性。第九十二页，共123页。反应条件的选择（影响显色反应的因素）2.溶液酸度的影响：介质酸度直接影响显色剂离解程度，从而影响显色反应的完全程度。

固定溶液中待测组分与显色剂的浓度，改变溶液酸度（pH值），测定溶液A与pH的关系曲线，找出最适pH范围。第九十三页，共123页。反应条件的选择（影响显色反应的因素）3.其他问题反应的时间、温度、放置的时间等。此外，加显色剂和试剂的顺序与实验成败有重要关系！第九十四页，共123页。反应条件的控制须通过实验确定显色反应最适宜条件。对于已建立的比色方法，不应随意更改条件。需要改变条件，或新建方法中要考察某一条件对显色的影响时，可通过实验描绘吸光度-条件曲线，或不同条件下的吸光度-浓度曲线，从中选定适宜条件。第九十五页，共123页。3.4.3参比溶液的选择溶剂参比：待测试样组成简单，共存组分少且对测定波长几乎无吸收，可用溶剂做参比。试剂参比：在不加样品的条件下，加入所需试剂和溶剂。试样参比：除不含显色剂以外，其余成分都含有。平行操作参比：不含待测组分。第九十六页，共123页。3.4.4干扰及消除方法

干扰物的影响：干扰物本身有颜色或与显色剂形成有色化合物；在显色条件下，干扰物水解，析出沉淀使溶液浑浊；与待测离子或显色剂形成更稳定的配合物，使显色反应不能进行。第九十七页，共123页。3.4.4干扰及消除方法

消除方法：控制酸度，提高反应的选择性；选择适当的掩蔽剂，但不能与待测离子作用；与待测物生成惰性配合物；选择适当的测量波长；分离。第九十八页，共123页。3.5紫外-可见吸收光谱的应用紫外-可见吸收光谱适用于不饱和有机化合物，尤其是共轭体系的鉴定，以此推断未知物的骨架结构。利用紫外-可见吸收光谱进行化合物的定性鉴别，一般采用比较吸收光谱特征的方法。3.5.1定性分析（鉴别）第九十九页，共123页。3.5紫外-可见吸收光谱的应用3.5.1.定性分析1.对比吸收光谱特征数据：λmax,ε或A1cm1%

第一百页，共123页。3.5.1.定性分析2.对比吸光度的比值有多个吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰处测得吸光度的比值作为鉴别依据。例：中国药典规定，VitB12

在361nm与278nm吸光度的比值应为1.70～1.88，361nm与550nm吸光度的比值应为3.15～3.45.第一百零一页，共123页。3.5.1.定性分析3.对比吸收光谱的一致性将试样与已知标准品配成相同浓度的溶液，在同一条件下分别描绘吸收光谱，核对其一致性。例：醋酸可的松、醋酸氢化可的松与醋酸泼尼松三者有几乎完全相同的λmax,（240nm）、ε（1.57×104）和A1cm1%

（390），但它们的光谱曲线有差别，据此可得到鉴别。第一百零二页，共123页。3.5紫外-可见吸收光谱的应用4.纯度检查杂质检查杂质的限量检测第一百零三页，共123页。3.5紫外-可见吸收光谱的应用3.5.2结构分析用于判别顺反异构体和互变异构体（可以确定一些化合物的构型和构象）。第一百零四页，共123页。3.5.3定量分析1.

单组分定量方法单组分：样品溶液中含一种组分，或者在混合物溶液中待测组分的吸收峰与其他共存物质的吸收峰无重叠。紫外-可见吸收光谱常用于具有共轭体系的化合物的定量分析，灵敏度高，检出限低。第一百零五页，共123页。(1)标准曲线法(calibrationcurvemethod)

标准曲线：配制一系列不同浓度的标准溶液，以不含被测组分空白溶液为参比，分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图。

A

Ax

CxC吸光度-浓度曲线第一百零六页，共123页。

(2)

标准对比法

∵

A=klcA/c=kl

∴

AS/cS=AX/cX即:

cX=AX.csAS1.单组分定量方法同种物质、同台仪器、同一波长，所以标准和样品的k和l相等。方法简便，但误差较标准曲线法大。第一百零七页，共123页。2.

示差分光光度法(高吸光度示差法)

原理:1.采用浓度比试样含量稍低的已知浓度的标准溶液作为参比溶液，调100%；2.然后测量一个或数个标准溶液（其浓度均必须大于参比溶液的浓度）的吸光度和待测试样溶液的吸光度∆A（∆A=Ax-As）；3.用比较法或工作曲线法求得待测溶液的浓度。第一百零八页，共123页。2.

示差分光光度法以∆A与∆c做标准曲线，查得相应∆cx。

cx=cs+∆cx

cs是参比溶液的浓度应用：测定高含量组分第一百零九页，共123页。为什么示差分光光度法能准确测量高含量组分？

设：待测溶液浓度为cx，标准溶液（参比溶液）浓度为cs(cs<cx)。1.采用普通光度法以试剂空白为参比溶液分别测定二者的透光率。假设：测得的待测溶液透光率为：Tx=5%标准溶液（参比）透光率为：Ts=10%第一百一十页，共123页。2.

高含量组分测定

示差分光光度法2.采用示差光度法以标准溶液为参比溶液测定，此时是用标准溶液将仪器的