药物色谱分析

一、化学键合相特点和分类二、化学键合相填料新进展三、非极性键合相色谱法四、极性键合相色谱法五、离子交换键合相色谱法主要内容药物色谱分析第1页第一节化学键合相特点和分类定义一、特点：消除了担体表面活性作用点，去除了一些可能催化活性耐溶剂冲洗，使用过程中固定相流失热稳定性好表面改性灵活，轻易取得重复性产品载样量大，溶剂残留效应小，梯度洗脱平衡快药物色谱分析第2页二、化学键相稳定性键合相中Si-O-Si键易受Lewis酸、NaOH、KOH等亲电试剂进攻而断裂，在低pH和高pH条件下均不稳定。高温会使硅胶溶解，键合硅胶在150℃下使用为宜物理吸附水会与硅烷化试剂作用形成副产物,其在有机溶剂中溶解,造成表观键合相流失现象.三、化学键合相分类极性键合相、非极性键合相、离子交换键合相三种药物色谱分析第3页第二节化学键合相填料新进展发展方向：提升填料化学稳定性、热稳定性，以及改进选择性、提升分离度和适用性一、空间保护键合固定相在C18烷基侧链引入较大官能团，妨碍硅羟基与分析物相互作用，如异丙基或异丁基取代药物色谱分析第4页药物色谱分析第5页每个硅烷化试剂分子中含有两个硅原子，每个硅原子含有一个长链硅烷基官能团，如Agilent企业ZorbaxExtend-C18色谱柱，在高流动相中稳定性极佳，适于分离游离强碱性化合物二、双齿键合固定相药物色谱分析第6页处理利巴韦林等强水溶性药品在反相柱中分析难题，内嵌极性官能团是改进固定相和水溶液兼容能力路径。1、1995年Waters企业推出专利极性官能团嵌入技术，如右图三、内嵌极性基团键合固定相图9-5内嵌极性官能团结构示意图药物色谱分析第7页药物色谱分析第8页水屏蔽层能够掩蔽解离后带负电硅羟基，减少拖尾，另可降低脱水现象，使填料和样品作用完全，在含水量高流动相中，样品也有稳定保留和最正确峰形三、内嵌极性基团键合固定相药物色谱分析第9页药物色谱分析第10页药物色谱分析第11页2、Agilent企业ZorbaxBonus-RP色谱柱:内嵌酰胺基和三封端技术，图9-83、内嵌磺胺基官能团键合相，有更出众水解稳定性如图9-9（Dionex企业）药物色谱分析第12页4、Phenomenex企业SynergiFusion-RP色谱柱E采取极性嵌合及书疏水链来到达高选择性效果药物色谱分析第13页1999年Waters企业创造了杂交颗粒技术，制成了Xterra色谱柱填料含有分离效率高、峰形优良、范围宽、分析速度快，四、硅碳杂化硅胶药物色谱分析第14页药物色谱分析第15页药物色谱分析第16页五、优化柱床设计六、苯基丙胺键合固定相七、以氧化锆为基质键合固定相八、包覆型填料药物色谱分析第17页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）一、疏溶剂作用理论药物色谱分析第18页影响溶质分子色谱保留原因溶质分子中非极性部分总表面积对色谱保留值影响。键合相表面烷基总表面积对色谱保留值影响烷基含碳量、键合相表面含碳量对色谱行为有主要影响洗脱液表面张力对色谱保留值影响药物色谱分析第19页药物色谱分析第20页药物色谱分析第21页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）二、双保留机制药物色谱分析第22页药物色谱分析第23页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）三、非极性键合相色谱法流动相组成基本要求:纯度高、沸点适中、黏度小、化学稳定性好、紫外吸收本底小、对样品有较宽溶解范围、与所选色谱系统相匹配混合溶剂黏度普通高于纯溶剂黏度，流动相组成改变时压力升高现象在应用梯度洗脱时应尤其注意药物色谱分析第24页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）三、非极性键合相色谱法流动相基本组成1、一元溶剂系统：普通不采取纯水系统2、二元溶剂系统：普通采取洗脱能力较弱水作为底剂，再加入一定量与水相混溶有机溶剂作为调整剂，如甲醇、乙腈，也可考虑四氢呋喃3、三元溶剂系统：在二元溶剂系统基础上添加四氢呋喃、三乙胺、离子对试剂、缓冲盐、醋酸、磷酸等药物色谱分析第25页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）四、非极性键合相色谱法流动相设计标准标准解释首选溶剂非极性色谱首选溶剂为甲醇、乙腈、四氢呋喃，底剂为水多元溶剂由不一样组别纯溶剂与底剂（或极性调整剂）组成，普通不一样时使用两个相同组别纯溶剂洗脱能力以重点组分容量因子为2~5作为溶剂系统洗脱能力量度替换溶剂当不能抵达分离要求时，可用相同洗脱能力不一样溶剂系统代替原溶剂系统。离子抑制色谱在色谱柱耐受范围内，可加入调整剂，抑制弱酸解离或弱碱质子化，增加其分配系数。药物色谱分析第26页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）四、非极性键合相色谱法流动相设计标准（一）中性化合物分析减小保留值增加保留值使用碳链较短键合相C8、C4使用碳链较长键合相C18、使用极性低流动相，增加有机溶剂百分比使用极性大流动相，增加流动相中水百分比提升色谱柱温度提升色谱柱温度减小色谱柱长度增加色谱柱长度药物色谱分析第27页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）四、非极性键合相色谱法流动相设计标准（一）中性化合物分析1、改变有机溶剂百分比筛选步骤：100%乙腈80%乙腈60%乙腈40%乙腈药物色谱分析第28页药物色谱分析第29页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）四、非极性键合相色谱法流动相设计标准（一）中性化合物分析2、改变有机溶剂类型流动相洗脱强度与有机溶剂类型相关如图：药物色谱分析第30页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）四、非极性键合相色谱法流动相设计标准（一）中性化合物分析2、改变有机溶剂类型普通改变有机溶剂不会影响样品出峰次序，但也有特比如图：药物色谱分析第31页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）四、非极性键合相色谱法流动相设计标准（一）中性化合物分析3、使用混合有机溶剂：在二元系统不能分离时采取如图药物色谱分析第32页药物色谱分析第33页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）四、非极性键合相色谱法流动相设计标准（一）中性化合物分析3、使用混合有机溶剂采取下列图方法设计试验分离样品药物色谱分析第34页例：取代萘溶剂选择性试验，如图药物色谱分析第35页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）四、非极性键合相色谱法流动相设计标准（二）酸性化合物和碱性化合物分析：与中性化合物分析相同，区分是加入pH值调整剂和缓冲盐。pH值选择：目标是调整流动相pH值或利用同离子效应，抑制样品组分解离，增加其在固定相中溶解度，到达分离有机弱酸弱碱目标，称为离子抑制色谱（ISC）适于分析3.0≤pKa≤7.0弱酸，7.0≤pKb≤8.0弱碱或两性化合物药物色谱分析第36页流动相对反相保留影响与样品类型（酸、碱、中性）关系，如图药物色谱分析第37页表酸性、碱性官能团pKa值取代基pKa酸性碱性酯基取代芳环取代酯基取代芳环取代磺酸,-SO3H11氨基酸2~49~12羧酸-COOH4~54~5硫醇,-SH10~116~7嘌呤2~49酚,-OH10~12吡嗪1亚砜,-SO1~2噻唑1~3胺，吡啶8~115咪唑7哌嗪10药物色谱分析第38页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）四、非极性键合相色谱法流动相设计标准（二）酸性化合物和碱性化合物分析：缓冲盐选择：目标是维持组分在色谱柱内平衡，得到很好重现性。要求：应含有适当缓冲容量缓冲溶液浓度应适当，普通为10~50mmol/L与色谱系统相匹配，注意缓冲剂截止波长缓冲液挥发性，应尽可能选择挥发性缓冲盐药物色谱分析第39页第三节非极性键合相色谱法

（non-polarbondedphasechromatography）四、非极性键合相色谱法流动相设计标准（二）酸性化合物和碱性化合物分析：胺类添加剂：在分析碱性化合物时抑制拖尾现象药物色谱分析第40页药物色谱分析第41页建立酸性和碱性样品分析方法步骤图示药物色谱分析第42页分析酸性和碱性药品时常见问题及方法分析碱性药品时会遇见常见问题及处理方法常见问题原因处理方法色谱峰拖尾或不出峰亲醇基效应所致流动相中加入小分子有机胺使用离子对技术添加缓冲液色谱峰裂分或多重峰进样后游离药品与质子化药品在流动相中重新平衡所致流动相溶样后再进样调整进样溶液pH值药物色谱分析第43页分析酸性和碱性药品时常见问题及方法分析酸性药品时会遇见常见问题及处理方法常见问题原因处理方法色谱峰拖尾或不出峰待测物质离子化所致调整流动相pH值至酸性加入酸性缓冲液进行离子抑制色谱峰裂分或多重峰二次化学平衡所致流动相溶样后再进样调整进样溶液pH值药物色谱分析第44页第四节极性键合相色谱法

（polarbondedphasechromatography）极性键合色谱法特征优点缺点使用非水流动相时，色谱柱稳定可改变流动相或色谱柱来改变分离选择性尤其适适用于在水溶液中易降解化合物溶剂黏度低，柱压低有机谷物多溶于正相色谱溶剂，适于制备液相离子型样品适于非极性色谱不易控制溶剂强度有时柱效较非极性色谱低低沸点溶剂易挥发或产生气泡吸附水使样品保留不稳定，有时不能采取梯度洗脱有