微生物的实验室培养专家讲座

微生物包含哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生动物特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有甚至没有细胞结构.且体内普通不含有叶绿素.不能进行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界微生物基础知识微生物的实验室培养专家讲座第1页一、基础知识：（一）培养基

培养基（培养液）是由人工方法配制而成，专供微生物生长繁殖使用混合营养液。（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、判定等。（2）按功效来分，可分为选择培养基和判别培养基。（3）按成份来分，可分为天然培养基和合成培养基。1.培养基类型和用途微生物的实验室培养专家讲座第2页培养基种类液体培养基半固体培养基固体培养基据物理性质分天然培养基合成培养基据化学成份分选择培养基判别培养基据用途分惯用于工业生产惯用于观察微生物运动、判定菌种用于微生物分离、计数惯用于工业生产惯用于分类、判定在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要微生物生长，促进所需要微生物生长。比如，在培养基中加入青霉素，以抑制细菌、放线菌生长，从而分离到酵母菌和霉菌。又如，在培养基中加入高浓度食盐能够抑制各种细菌生长，但不影响金黄色葡萄球菌生长。依据微生物代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以判别不一样种类微生物。比如，在培养基中加入伊红和美蓝，能够用来判别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌：假如有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。微生物的实验室培养专家讲座第3页标准培养基类型配制特点主要应用物理性质固体培养基加入琼脂较多菌种分离,判定,计数半固体培养基加入琼脂较少菌种保留液体培养基不加入琼脂工业生产，连续培养化学组成合成培养基由已知成份配制而成，培养基成份明确菌种分类、判定天然培养基由天然成份配制而成，培养基成份不明确工业生，产降低成本目标用途判别培养基添加某种指示剂或化学药剂菌种判别选择培养基添加（或缺乏）某种化学成份菌种分离微生物的实验室培养专家讲座第4页固体培养基：菌落微生物的实验室培养专家讲座第5页液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长微生物的实验室培养专家讲座第6页半固体培养基：无动力有动力(弥散)(是否运动)

微生物的实验室培养专家讲座第7页选择培养基加入青霉素培养基:

分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐培养基:

分离金黄色葡萄球菌不加氮源无氮培养基:

分离固氮菌不加含碳有机物无碳培养基:

分离自养型微生物微生物的实验室培养专家讲座第8页大肠杆菌呈黑色中心,有金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝培养基上经典特征

判定培养基：判定所培养生物类型微生物的实验室培养专家讲座第9页2、培养基配制标准：

（1）目标要明确：依据微生物种类、培养目标等确定配制培养基种类，因为不一样微生物对培养物质需求不一样。（2）营养要协调：注意各种营养物质浓度和百分比。（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长pH范围不一样。细菌pH为：6.5-7.5；放线菌pH为：7.5-8.5；真菌pH为：5.0-6.0。微生物的实验室培养专家讲座第10页3、培养基营养组成

不论哪种培养基，普通都含有水、碳源、和氮源、无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,比如:生长因子(即细菌生长必需，而本身不能合成化合物,如维生素、一些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等要求。

微生物的实验室培养专家讲座第11页碳源、氮源、生长因子比较来源惯用原料功能碳源CO2、NaHCO3、糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等糖类组成细胞物质和一些代谢产物，有些还是异养做生物主要能源物质氮源N2、NH3、铵盐、硝酸盐、尿素、牛肉膏和蛋白胨等铵盐、硝酸盐等合成蛋白质、核酸以及含氮代谢产物生长因子维生素、氨基酸、碱基酶、核酸等组成成份微生物的实验室培养专家讲座第12页（二）无菌技术1.无菌技术概念

无菌操作泛指在培养微生物操作中，全部预防杂菌污染方法。成功地培养微生物关键。无菌技术包含：

（1）对试验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒；

（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；

（3）为防止周围微生物污染，试验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；

（4）防止已灭菌处理材料用具与周围物品相接触。

微生物的实验室培养专家讲座第13页（１）消毒定义：

指使用较为温和物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害微生物。（不包含芽孢和孢子）2.消毒与灭菌概念及二者区分

使用强烈理化原因杀死物体内外全部微生物，包含芽孢和孢子，而到达完全无菌之过程。

灭菌消毒技术是微生物相关工作中最普通也是最主要技术。（2）灭菌定义：微生物的实验室培养专家讲座第14页比较项理化原因作用强度毁灭微生物数量芽孢和孢子能否被毁灭消毒较为温和部分生活状态微生物不能灭菌强烈全部微生物能消毒与灭菌比较微生物的实验室培养专家讲座第15页1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒……(1)消毒方法：3.惯用消毒与灭菌方法微生物的实验室培养专家讲座第16页1、灼烧灭菌接种环、接种针、试管口2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.(2)灭菌方法：微生物的实验室培养专家讲座第17页

最惯用灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它能够杀灭全部生物，包含最耐热一些微生物休眠体，同时能够基本保持培养基营养成份不被破坏。有些玻璃器皿也可采取高温干热灭菌。为了预防杂菌，尤其是空气中杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采取适宜塞子塞口，通常采取棉花塞，也可采取各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气经过，而空气中其它微生物不能经过。培养微生物培养皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为预防空气中微生物污染而设计。

微生物的实验室培养专家讲座第18页1.无菌技术除了用来预防试验室培养物被其它外来微生物污染外，还有什么目标？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。假如需要，请选择适当方法。（1）培养细菌用培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）试验操作者双手答：无菌技术还能有效防止操作者本身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。旁栏思考微生物的实验室培养专家讲座第19页3.微生物试验室培养基本操作程序1、器具灭菌2、培养基配制3、培养基灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种保留微生物的实验室培养专家讲座第20页三、试验操作（一.）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）微生物的实验室培养专家讲座第21页1．计算、称量2．溶化3．调pH：pH7．6

4．过滤：这一步能够省去。5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引发污染。分装三角烧瓶量以不超出三角烧瓶容积二分之一为宜。6．加塞7．包扎操作步骤微生物的实验室培养专家讲座第22页8．灭菌:

将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170℃下灭菌2h。9．倒平板:

待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见书本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.10．无菌检验：将灭菌培养基放入37℃温室中培养24—48小时，以检验灭菌是否彻底。微生物的实验室培养专家讲座第23页倒平板技术微生物的实验室培养专家讲座第24页1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么方法来预计培养基温度？问题讨论答：能够用手触摸盛有培养基锥形瓶，感觉锥形瓶温度下降到刚才不烫手时，就能够进行倒平板了。2.为何需要使锥形瓶瓶口经过火焰？答：经过灼烧灭菌，预防瓶口微生物污染培养基。微生物的实验室培养专家讲座第25页3.平板冷凝后，为何要将平板倒置？4.在倒平板过程中，假如不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为何？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后培养基表面湿度也比较高，将平板倒置，既能够使培养基表面水分更加好地挥发，又能够预防皿盖上水珠落入培养基，造成污染。答：空气中微生物可能在皿盖与皿底之间培养基上滋生，所以最好不要用这个平板培养微生物。微生物的实验室培养专家讲座第26页（二）、纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法

平板划线法:经过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线操作,将聚集菌钟逐步稀释分散到培养基表面.

在数次画线后,能够分离到由一个细胞繁殖而来肉眼可见子细胞群体,这就是菌落.微生物接种技术微生物的实验室培养专家讲座第27页菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见，含有一定形态结构子细胞群体，叫做菌落。菌落是判定菌种主要依据。微生物的实验室培养专家讲座第28页菌落细菌菌落特征因种而异微生物的实验室培养专家讲座第29页霉菌菌落特征因种而异菌落微生物的实验室培养专家讲座第30页接种环接种针微生物的实验室培养专家讲座第31页微生物的实验室培养专家讲座第32页问题讨论

1.为何在操作第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，依然需要灼烧接种环吗？为何？

答：操作第一步灼烧接种环是为了防止接种环上可能存在微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留菌种，使下一次划线时，接种环上菌种直接起源于上次划线末端，从而经过划线次数增加，使每次划线时菌种数目逐步降低，方便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留菌种，防止细菌污染环境和感染操作者。微生物的实验室培养专家讲座第33页

2.在灼烧接种环之后，为何要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。

3.在作第二次以及其后划线操作时，为何总是从上一次划线末端开始划线？

答：划线后，线条末端细菌数目比线条起始处要少，每次从上一次划线末端开始，能使细菌数目伴随划线次数增加而逐步降低，最终能得到由单个细菌繁殖而来菌落。微生物的实验室培养专家讲座第34页微生物的实验室培养专家讲座第35页涂布器微生物的实验室培养专家讲座第36页微生物的实验室培养专家讲座第37页问题讨论

涂布平板全部操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释无菌操作要求，想一想，第2步应怎样进行无菌操作？

应从操作各个细节确保“无菌”。比如，酒精灯与培养皿距离要适当、吸管头不要接触任何其它物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。微生物的实验室培养专家讲座第38页微生物恒温培养微生物恒温培养微生物的实验室培养专家讲座第39页3．1培养未接种培养基作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。3．2在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。3．3培养12h和24h后菌落大小不一样（相同、不一样）；菌落分布位置相同（相同、不一样）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落位置不动，但菌落数增多。3．4在某培养基上出现了3种特征不一样菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。结果分析与评价（P20）微生物的实验室培养专家讲座第40页四、课题结果评价

（一）培养基制作是否合格假如未接种培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基制备是成功，不然需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求假如培养基上生长菌落颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落特点，

(在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐)则说明接种操作是符合要求；假如培养基上出现了其它菌落，(在某培养基上出现了3种特征不一样菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。)则说明接种过程中，无菌操作还未到达要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致观察与统计培养12h与24h后大肠杆菌菌落大小会有显著不一样，及时观察统计同学会发觉这一点，并能观察到其它一些细微改变。这一步要求主要是培养学生良好科学态度与习惯。微生物的实验室培养专家讲座第41页菌种保留1、暂时保藏法对象：温度：缺点：

2、甘油管藏法：

对象：

温度：频繁使用菌种4℃（冰箱）轻易被污染或产生变异长久保留菌种-20℃（冷冻箱）课题延伸微生物的实验室培养专家讲座第42页本课题知识小结:微生物的实验室培养专家讲座第43页【典例解析】例1．关微生物营养物质叙述中，正确是A.是碳源物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量解析：不一样微生物，所需营养物质有较大差异，要针对微生物详细情况分析。对于A、B选项，它表示是不完整。有碳源只能是碳源，如二氧化碳；有碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有碳源同时是能源，如葡萄糖；有碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外无机物种类繁多，功效也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量情况还是存在，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。答案：D微生物的实验室培养专家讲座第44页例2．下面对发酵工程中灭菌了解不正确是A.预防杂菌污染B.毁灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前答案：B解析：灭菌是微生物发酵过程一个主要步骤。A说是灭菌目标，因为发酵所用菌种大多是单一纯种，整个发酵过程不