植物细胞转基因技术专家讲座

植物细胞转化方法种类及特点植物细胞转基因技术专家讲座第1页植物转基因技术普通操作过程植物细胞转基因技术专家讲座第2页

间接转化法：农杆菌介导法病毒介导法植物基因转化技术方法

DNA直接转化法：基因枪法电击法花粉管通道法化学物质诱导法显微注射法脂质体法植物细胞转基因技术专家讲座第3页

间接转化法是以生物体为媒介植物转基因方法,有农杆菌介导法和病毒介导法。

间接转化法植物细胞转基因技术专家讲座第4页

农杆菌介导法是以农杆菌为媒介对植物进行遗传转化方法。1.农杆菌介导法植物细胞转基因技术专家讲座第5页

它是经过根癌农杆菌Ti质粒(Tumerinducingplasmid)和发根农杆菌Ri质粒(Rootinducingplasmid)上一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤过程中,T-DNA能够被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。

植物细胞转基因技术专家讲座第6页T-DNA能够进行高频率转移,而且Ti质粒和Ri质粒上能够插入到50kb外源基因,所以Ti质粒和Ri质粒就成为植物基因转化理想载体系统。植物细胞转基因技术专家讲座第7页

T-DNA能够将其携带外源基因整合到植物基因组中，T-DNA上较主要是T区两端左右边界各为25bp重复序列。其中14bp是中心,分10bp和4bp两组,是完全保守。这两个边界是T-DNA转移所必需。其中尤以右边界最为重要。T-DNA植物细胞转基因技术专家讲座第8页vir基因

Ti质粒vir区大小为30kb,分VirA、B、C、D、E、G、H等7个操纵子,一共有24个基因共同控制着T-DNA加工和转移,它们总称调控子。植物细胞转基因技术专家讲座第9页叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡筛选培养基愈伤组织分化幼苗植物细胞转基因技术专家讲座第10页优点：

技术较成熟,转化效率高操作简单，不需要特殊仪器，培养周期短外源基因多以单拷贝或低拷贝插入受体细胞,稳

定性好，降低了共抑制等基因缄默现象。可将较大片段DNA完整地转移到植物基因组中

等。植物细胞转基因技术专家讲座第11页缺点：主要转化双子叶植物。T-DNA能够在植物染色体任何区域内插入,有可能造成有益基因插入失活。迄今所取得近200种转基因植物中80%以上是经过根癌农杆菌系统转化取得。植物细胞转基因技术专家讲座第12页病毒介导法是以病毒为媒介对植物进行遗传转化

载体系统。详细来说就是将外源基因插入到病

毒基因组中,经过病毒对植物细胞感染而将外源

基因导入植物细胞一个植物转基因方法。2.病毒介导法植物细胞转基因技术专家讲座第13页利用植物病毒介导法对植物基因进行遗传转化效

率比较高,但它安全性受到质疑,主要用于动物

基因转移。

植物细胞转基因技术专家讲座第14页

直接转化法(又称DNA直接导入法),它指不依赖于生物体将裸露DNA直接转移到植物细胞和原生质体中,造成细胞转化技术,与间接转化法相比,直接转化法不需构建载体,所以又叫无载体介导转化法。它适合用于对农杆菌侵染不敏感植物,使用此法前提是需要建立良好细胞或原生质体培养及再生系统。DNA直接转移法植物细胞转基因技术专家讲座第15页

DNA直接导入法最大优点是无需选择宿主,能够导入生物细胞；缺点是嵌合基因整合进宿主染色体频率低。该方法能够分为化学物质诱导法、电穿孔法、脂质体法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法和花粉管通道法。植物细胞转基因技术专家讲座第16页基因枪法电击法花粉管通道法化学物质诱导法显微注射法脂质体法植物细胞转基因技术专家讲座第17页

基因枪法最早是由美国康奈尔大学Sanford最先提出。它经过高速飞行金属颗粒将包被其外目标基因直接导入到受体细胞内，最终整合到植物基因组并得以表示从而实现基因转化方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是经过该法取得。

1.基因枪法植物细胞转基因技术专家讲座第18页DNA1.2m钨弹头吸附特制手枪射击植物装入植物细胞转基因技术专家讲座第19页植物细胞转基因技术专家讲座第20页优点：克服了受体材料限制，无须制备原生质体。试验操作简单易行，适合于大多数细胞或组织，含有相当广泛应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。缺点：进去DNA片段整合效率极低，遗传稳定性差，拷贝数多，不易取得再生植株。植物细胞转基因技术专家讲座第21页

至今为止,该法已成为除了农杆菌介导转化法以外应用最广泛基因转移技术。此法已在葡萄、水稻等植物转基因中应用,并取得转基因植株。基因枪法也能够有效地用于叶绿体转化，还能够转移RNA、DNA克隆等。植物细胞转基因技术专家讲座第22页

是在高压电脉冲作用下在新鲜分离原生质体质膜上形成瞬时可逆性开放小孔,为外源DNA提供通道,借此导入DNA等遗传物质,到达转化目标。由于质膜含有可修复性,外加电压造成膜穿孔可在一定时间内自动修复,从而使细胞恢复到正常生理情况。2.电击法植物细胞转基因技术专家讲座第23页植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2kV,3-25F电击愈伤组织幼苗分化植物细胞转基因技术专家讲座第24页优点：操作简便，能够一次转化许多原生质体，转化效率较高，尤其适于瞬间表示。缺点：有原生质体培养麻烦,电穿孔易造成原生质体损伤使再生率降低。

该法已在甘蔗、大麦小孢子、剪股颖等植物基因转化当中。植物细胞转基因技术专家讲座第25页花粉管通道法是利用植物授粉后,所形成天然花粉管通道,经珠心通道,将外源DNA携带入胚囊,从而到达转化目标一个植物转基因方法。3.花粉管通道法植物细胞转基因技术专家讲座第26页优点：

适用范围广，不依赖组织培养人工再生植株；

可直接取得转基因种子，育种时间短，在判定

时可直接针对目标性状表现型来进行,简单快

捷；

转化速度较快，变异性状稳定较快；

方法简单,不需要复杂昂贵仪器设备。植物细胞转基因技术专家讲座第27页缺点：转化受体受植物花期限制，同时必须充分了解

每一个植物开花受精时间过程。在自然田间进行操作，受环境条件影响很大。操作经验性很强,需要一定技巧。利用此方法取得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物转基因植株。植物细胞转基因技术专家讲座第28页化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于特定化学物质诱导DNA直接导入植物细胞方法。惯用转化细胞化学物质有PEG(聚乙二醇)、PLO(多聚鸟氨酸)、PVA(聚乙烯醇)等,其中PEG法应用较多,效果很好。PEG法是一个经过化学物质PEG处理去壁原生质体作为转化受体,改变细胞膜通透性使原生质体取得转化方法。4.化学物质诱导法植物细胞转基因技术专家讲座第29页优点：PEG法操作简单、成本低、结果较稳定、重复性

好、无需昂贵基因转化仪器，且嵌合转化体很

少产生。

植物细胞转基因技术专家讲座第30页缺点：原生质体培养再生难度较大；原生质体再生培养转化植株变异率高,易产生白

化苗，且因为PEG法对原生质体活力有害，转化

率低。应用这种方法已成功取得大麦、柑桔、胡椒等植物转基因植株。植物细胞转基因技术专家讲座第31页显微注射法是使用毛细微管(普通针尖直径为

0.5nm),在显微镜下将外源DNA注射入植物细胞

或原生质体中一个直接而完善方法。5.显微注射DNA植物细胞转基因技术专家讲座第32页该方法是Pena等1987年首创,在用此方法进行

基因导入时,通常需要把原生质体或培养细胞固

定在琼脂或低熔点琼脂糖上,或用聚赖氨酸处理

使原生质体附着在玻璃平板上,也能够经过一固着毛细管将原生质体吸着在管口,再进行操作。

植物细胞转基因技术专家讲座第33页优点：转化率高，尤其是在没有适当DNA载体系统时

更有价值对转移物质没有限制，可选择受体细胞核接

受位点受体不用特殊选择系统能够控制转移量和转移物浓度植物细胞转基因技术专家讲座第34页缺点：设备和技术要求较高要想取得转化植株,需要注射大量细胞或原生质体，费时费工对细胞有损伤，一次处理细胞数量不能太多，比较适合大细胞操作，主要用于动物基因转化中植物细胞转基因技术专家讲座第35页脂质体是依据生物膜结构和功效特征，人工用

脂类化合物合成双层膜囊。脂质体法是Dellaporta等在1981年创造,就是将

包含外源基因脂质体与植物原生质体融合,从而

到达转基因目标一个转化方法。6.脂质体法植物细胞转基因技术专家讲座第36页优点：可防止DNA在导入受体细胞之前被核酸酶降解；适用植物种类广泛重复性高,包装在脂质体内

DNA或RNA可稳定地贮藏。植物细胞转基因技术专家讲座第37页缺点：在包装DNA时必须有短时间超声处理,会使相当

多DNA断裂；

所用材料必使用含有全能性原生质体作为受体

细胞；转化效率较低。

主要用于动物基因转化,在植物上此方法介导基因转移在烟草、青菜等植物上有报道。植物细胞转基因技术专家讲座第38页几个植物转基因方法比较转基因方法转化优点转化缺点DNA间接转化法农杆菌介导基因转移受体种类，能够在原生质体、和细胞团、组织器官或整株等多级水平上进行，方法成熟可靠，简便易行，周期短，转化率高；转化双子叶植物为主。大多数单子叶植物和