植物基因工程技术及应用专家讲座

转基因植物种植转基因植物种类主要有大豆（占54％）、玉米（占28％）、棉花（占9％）、油菜（占9％），马铃薯、西葫芦和木瓜百分比都小于1％。按转基因植物性状划分，抗除草剂占71％，抗虫占22％，抗虫兼抗除草剂占7％，抗病毒和其它性状转基因植物百分比小于1％。至1999年，农业部同意可进行商业化生产国内研制转基因植物有5种，它们分别是：抗虫棉花、改变花色矮牵牛、延熟番茄、抗病毒甜椒和番茄。

植物基因工程技术及应用专家讲座第1页（一）转基因植物发展进程与规模

1983年，首批转基因作物（烟草、马铃薯）问世。1986年，首批转基因作物（抗虫、抗除草剂）进入田间试验，美国和法国同时反抗除草剂转基因烟草进行了田间试验

1992年，中国首先在大田种植转基因抗病毒烟草，揭开了全球转基因作物商业化序幕。1994年，美国转基因作物产品（耐储存番茄FlavorSavor

）进入市场。1994年，商品化种植抗黄瓜花叶病毒（CMV）和抗烟草花叶病毒（TMV）双价转基因烟草

1996年后，转基因作物产业化得到快速发展。同时带有八种基因代码转基因玉米将于年在美国问世。

植物基因工程技术及应用专家讲座第2页1998年，全世界共有7000万英亩大田种植转基因作物。1999年又增至9860万英亩，年增加率超出40%。年年增加率突降至10.8%，其中美国降幅最大。年2月24日统计种植面积排名前三位国家分别为，美国（6250万公顷）、阿根廷（2100万公顷）和巴西（1580万公顷）。中国全国生物技术作物种植面积达380万公顷，在全球生物技术作物种植面积超出100万公顷八个国家中排名第六种植面积排名前十国家，依次是美国、阿根廷、巴西、加拿大、印度、中国、巴拉圭、南非、乌拉圭、菲律宾。植物基因工程技术及应用专家讲座第3页商业化种植转基因作物国家数年份国家数植物基因工程技术及应用专家讲座第4页（亿美元）

国际农业生物技术应用跟踪调查服务处（ISAAA）预计，全球转基因产品市场：转基因产品市场现实状况与展望植物基因工程技术及应用专家讲座第5页美国是转基因食品发源地,也是当今世界转基因食品生产和出口最多国家。1983年,全球第一个转基因农作物———马铃薯就诞生在美国。据预计,当前美国零售食品中有60%以上含有转基因成份,90%以上大豆、50%以上玉米、小麦是转基因。植物基因工程技术及应用专家讲座第6页采取当代生物技术伎俩，培育出一批优质、专用、高产、多抗农作物新品种。转基因技术与产业化快速发展，我国已成为世界第五大转基因植物种植国家，年，我国棉花种植面积8095万亩，其中生物技术棉花种植面积已超出总面积75%，河北、山东、河南、安徽等棉花主产省国产生物技术棉花种植率已到达100%，棉花单产到达80千克/亩历史高水平，增幅为6.3%-7.0%，棉花总产量达650万吨，创历史新高，且棉花品质普遍看好。经过数字农业技术应用，大幅度提升了示范区农业信息化和当代化管理水平，加速了利用高新技术改造传统农业步伐。植物基因工程技术及应用专家讲座第7页1.提取DNA（二）转基因技术有SDS法和CTAB法，常采取CTAB法提取方法基因组DNA。并用分光光度计测定浓度和质量。然后用去离子水将其稀释至50ng·uL-1备用叶片加液氮，快速研磨成粉末DNA提取缓冲液2×CTAB，充分混匀60℃水浴45-60min，其间轻柔摇匀2-3次冷却至室温，加入等体积氯仿:异戊醇（24:1）轻柔且充分混匀，静置10min1rpm离心10min取上清，加入0.7倍体积冷异丙醇，轻柔摇动离心管充分混匀，室温放置10-20min10000rpm离心10min小心弃去上清，加入70%乙醇洗涤2次沉淀，室温下微干，溶于适量TE缓冲液DNA检测用0.8%琼脂糖胶植物基因工程技术及应用专家讲座第8页15000bp1000bp250bp植物基因工程技术及应用专家讲座第9页（1）取得目标基因方法①从生物基因组群体中分离目标基因

采取限制性内切酶切割2.取得目标基因植物基因工程技术及应用专家讲座第10页DNA1μg缓冲液2μL重蒸水酶液+用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3h电泳检测EP管编号,加样操作步骤植物基因工程技术及应用专家讲座第11页②化学合成目标基因DNA片段采取DNA合成仪③PCR(聚合酶链式反应)合成DNA惯用方法

植物基因工程技术及应用专家讲座第12页PCR过程示意图植物基因工程技术及应用专家讲座第13页植物基因工程技术及应用专家讲座第14页植物基因工程技术及应用专家讲座第15页④mRNA差异显示法取得目标基因基因在细胞中特异表示是否，决定了生命历程中细胞发育和分化、细胞周期调整、细胞衰老和死亡等。用于分离特异表示基因。

⑤用机械方法如超声波把基因组打成片段。

（2）PCR取得目标基因①设计引物在NCBI(美国国立生物技术信息中心)/引物设计软件Primerprimer5.0设计引物，然后合成引物。植物基因工程技术及应用专家讲座第16页PCR反应混合液

扩增条件：94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25～30个循环。②PCR植物基因工程技术及应用专家讲座第17页③特异片段回收、连接与转化将扩增产物用1%琼脂糖凝胶（EB染色）在100V电压电泳液中电泳40min在紫外灯下用刀片切取带有特异带胶块，并把该胶块转移到1.5ml离心管中回收片段按照胶回收试剂盒进行目标片段与克隆载体连接（pGEM–Teasyvector或pMD18-T）在4℃条件下连接12h-16h采取热激法，将连接产物转化转化至大肠杆菌感受态细胞E.coliJM109将全部菌液涂于含Amp（X-gal为40µl，IPTG为4µl）LB平板上，半小时后倒置37℃培养8-12h左右，可出现菌落植物基因工程技术及应用专家讲座第18页④克隆筛选与判定

蓝白斑筛选重组子PCR判定质粒提取及质粒酶切判定

⑤测序送生物技术企业，用DNA测序仪测序。⑥序列比对在NCBI或者DNAman上进行比对，确认基因是否正确。植物基因工程技术及应用专家讲座第19页植物基因工程技术及应用专家讲座第20页3.构建植物表示载体（1）载体在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目标基因）转移至受体细胞一个能自我复制DNA分子。三种最惯用载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。按用途分为：克隆载体，表示型载体，分泌型载体，穿梭载体等。一是用它作为运载工具；利用它在宿主细胞内对目标基因进行大量复制(称为克隆)。

在宿主细胞中能保留下来并能大量复制；有多个限制酶切点，而且每种酶切点最好只有一个，可适于各种限制酶切割DNA插入；含有复制起始位点ori

，能够独立复制；有一定标识基因，便于进行筛选。

载体必须含有四个条件植物基因工程技术及应用专家讲座第21页能独立复制并稳定传代:复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝粒,端粒方便插入外源片段:酶切位点选择标识:药品抗性汇报基因:插入筛选标识易分离提取高产率（多拷贝）强开启子多宿主植物基因工程技术及应用专家讲座第22页植物基因工程技术及应用专家讲座第23页Transform+reportgenesubstrates植物基因工程技术及应用专家讲座第24页（1）转化方式依据所用载体类型以及转化对象不一样普通有以下主要转化方式:

（1）基因枪转化（2）电转化（3）融正当（4）花粉管转化（5）农杆菌介导4.高等植物基因转化与植株再生植物基因工程技术及应用专家讲座第25页（1）基因枪转化法利用基因枪装置，将钨粉或金粉与DNA吸附制成“子弹”经过高压放电将“子弹”加速到482m/s，在这种速度下，金属粒子能穿透植物细胞壁，击发一次可将成千上万个带有外源DNA金属粒子同时射入完整细胞或器官。优点：单子叶和双子叶都可使用缺点：成本高，操作麻烦，DNA片段整合效率极低。通常只应用于单子叶。植物基因工程技术及应用专家讲座第26页（2）电击法用电转化仪将高浓度质粒DNA加入到植物细胞原生质体悬浮液中，混合物在200-600V/cm电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长1-2周，再生出整株植物。

植物基因工程技术及应用专家讲座第27页（3）融正当

将外源DNA与特殊疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。

原生质体极难再生出整株植物。植物基因工程技术及应用专家讲座第28页（4）花粉管导入法

使用显微注射器，将外源DNA沿着花粉管经过珠心进入还未形成正常细胞壁卵、合子或早期胚胎细胞中，实现基因转移。是由我国科学家周光宇首先提出设计，当前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物转基因研究，

花粉管导入法特点是直接、简便。它受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养诱导和传代过程，排除了植株再生障碍，尤其适合于难以建立有效再生系统植物。因为转化是完整植株卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入DNA分子整合效率较高。植物基因工程技术及应用专家讲座第29页（5）农杆菌介导

几乎全部双子叶植物尤其是豆科类植物根部经常会形成根瘤，这是因为植物根部被一个革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特征是由该菌细胞内野生型质粒Ti介导。植物基因工程技术及应用专家讲座第30页二元整合转化程序将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒T-DNA区内；重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区Ti辅助质粒；植物基因工程技术及应用专家讲座第31页（2）农杆菌介导外源基因转移技术普通操作①将表面消毒叶片切成小块②小块在过夜培养并稀释到一定浓度含外源基因根癌农杆菌液中共培养几分钟，使让根癌农杆菌感染叶片切块伤口。③从菌液中捞出小叶块，培养基中培养2天。④在含头孢霉素选择培养基中筛选转化细胞。继续培养，转化细胞分化出芽。⑤将芽转入含有抗生素生根培养基上，诱导生根。⑥将完整转基因植株移栽到土壤中。植物基因工程技术及应用专家讲座第32页abcd植物基因工程技术及应用专家讲座第33页分子判定:PCRSouthernblotNorthernblotWesternblot蛋白质电泳5.转基因植株判定及分析植物基因工程技术及应用专家讲座第34页Southernblot植物基因工程技术及应用专家讲座第35页Northernblot

植物基因工程技术及应用专家讲座第36页Westernblot和蛋白质电泳植物基因工程技术及应用专家讲座第37页（三）转基因生物商业化普通流程

1.试验室试验步骤：经过了试验室试验，技术成熟之后才开始进行中间试验步骤。2.中间试验步骤：这个步骤在田间进行，普通需要两年左右时间。田间管理评价包含详细位置、与人群距离、面积、隔离等多项详细要求。

3.环境释放评价：需要两年。在这个步骤试验能够再扩大一些面积，但也有很多要求，也必须在相对封闭环境下进行。

4.生产试验：生产试验规模能够深入扩大。本阶段评价主要是评定转基因生物对环境是否有影响和压力。5.假如要做食品，需要再对独立性、致敏性、抗营养因子等进行评价，还需要提交综合性评价。”

按照中国现行同意流程，转基因商业化同意有年限控制，普通时限是4年。4年到期后，需要重新报批。

植物基因工程技术及应用专家讲座第38页（四）种植转基因植物风险性

破坏生态环境和影响人类健康。1.安全性问题转基因植物存在用于选择性标识抗生素，以及导入植物DNA序列在加工过程中可能出现改变。2.环境及生态问题导入植物目标基因是否转入其它植物，是否会破坏生态平衡。植物基因工程技术及应用专家讲座第39页

首先是毒性问题。一些研究学者认为，对于基因人工提炼和添加，可能在到达一些人们想到达效果同时，也增加和积聚了食物中原有微量毒素。

其次是过敏反应问题。对于一个食物过敏人有时还会对一个以前他们不过敏食物产生过敏，比如：科学家将玉米某一段基因加入到核桃、小麦和贝类动物基因中，蛋白质也随基因加了进去，那么，以前吃玉米过敏人就可能对这些核桃、小麦和贝类食品过敏。

第三是营养问题。科学家们认为外来基因会以一个人们当前还不甚了解方式破坏食物中营养成份。

第四是反抗生素抵抗作用。当科学家把一个外来基因加入到植物或细菌中去，这个基因会与别基因连接在一起。人们在服用了这种改良食物后，食物会在人体内将抗药性基因传给致病细菌，使人体产生抗药性。

第五是对环境威胁。在许多基因改良品种中包含有从杆菌中提取出来细菌基因，这种基因会产生一个对昆虫和害虫有毒蛋白质。在一次试验室研究中，一个蝴蝶幼虫在吃了含杆菌基因马利筋属植物花粉之后，产生了死亡或不正常发育现象，这引发了生态学家们另一个担心，那些不在改良范围之内其它物种有可能成为改良物种受害者。

最终，生物学家们担心为了培养一些更具优良特征，比如说含有更强抗病虫害能力和抗旱能力等，而对农作物进行改良，其特征很可能会经过花粉等媒介传输给野生物种。植物基因工程技术及应用专家讲座第40页③“三明治”事件由含有抗虫性Bt基因转基因玉米做成。这种玉米可产生一个Cryge蛋白质，此物是一潜在致过敏性源。所以美国食品与药品管理局（FDA）只同意这种玉米作饲料而非食用具。

美国一家食品企业生产一个油炸三明治——Taco，上下夹层是玉米粉，中间为肉馅。使人们对转基因作物及其产品安全性问题充满了忧虑植物基因工程技术及应用专家讲座第41页转基因植物几个经典事件①“马铃薯”事件英国《独立报》披露了转基因食品巨头孟山都企业一份秘密汇报不能确定转基因和非转基因马铃薯化学成份有什么差异对使用转基因土豆大鼠，没有补充蛋白质以预防饥饿供试动物数量少，饲喂几个食物都不是大鼠标准食物试验设计差，未作双盲测定统计方法不妥，试验结果无一致性试验错误含雪花莲凝集素基因土豆体重和器官减轻，免疫系统受到破坏植物基因工程技术及应用专家讲座第42页②“斑蝶”事件（1999年５月，康奈尔大学一个研究组在《Nature》杂志上发表文章）但2年后美国组织了多个大学和研究部门进行了大量试验，得出了科学结论：玉米花粉重，扩散不远田间试验表明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不组成威胁转基因抗虫玉米花粉“马利筋”44%幼虫死亡北美珍稀濒危大斑蝶杂草

斑蝶幼虫真正死因

农药使用过分生态环境破坏植物基因工程技术及应用专家讲座第43页（五）转基因植物安全评价与检测安全性评价主要包含两部分：一是对人类健康影响，一是对环境影响。“这是由授权第三方机构进行安全性研究，植物基因工程技术及应用专家讲座第44页对农业转基因生物实施安全管理是国际上普遍做法。国际经合组织（OECD）、联合国粮农组织（FAO）、环境保护规划署（UNEP）、生物安全议定书、食品法典委员会，都对转基因生物安全提出了明确要求。安全性评价是国际上通行做法。因为各国农业、环境和生物多样性差异，决定了只有本国确认了安全性之后，转基因生物才能投入商业应用或由输出国引进。日本、欧盟、美国等国均实施安全性评价。美国是经过农业部、食品与药品管理局和环境保护局安全评价后才允许转基因作物商品化生产；欧盟是经过安全评价后才同意国内外转基因产品投放市场；日本是经过农林水产省安全评价后才许可转基因农产品进口。当前，按照《生物安全议定书》相关要求，对进口农业转基因生物实施安全评价管理，能够在收到申请之日起270日内做出批复。我国在制订《条例》及其配套规章过程中，对国外相关法规进行了比较研究。在安全评价中，遵照“个案分析”标准、“实质等同性”标准、“逐步完善”标准等。实施标识管理制度是使消费者有知情权和选择权。

“转基因管理是casebycase，个案分析标准，即使同一个品种在不一样地方，不一样批次都需要进行评价。”实质等同性标准，转基因植物生产产品与传统产品同一性状进行比较，含有实质等同性，则能够认为是安全。植物基因工程技术及应用专家讲座第45页农业转基因生物管理文件国务院在年就颁布了《农业转基因生物安全管理条例》(下称《条例》)。《条例》要求，国家农业转基因生物安全委员会(下称安委会)负责我国农业转基因生物安全评价工作。

年，农业部又公布了《农业转基因生物安全评价管理方法》、《农业转基因生物进口安全管理方法》和《农业转基因生物标识管理方法》三个配套规章。

我国还建立了由农业部、国家发改委、科技部、卫生部、国家质检总局和国家环境保护总局组成国家农业转基因生物安全管理部际联席会议制度。

植物基因工程技术及应用专家讲座第46页植物基因工程技术及应用专家讲座第47页在美国,一个基因作物要投入生产,需要同时接收3项审核。农业部负责监管基因作物进行田间试验结果,食品与药品管理局(FDA)负责对基因食品安全性审核,而环境保护署则负责对该基因作物对环境影响评定。凡是经过科学评价和政府部门严格审批获准上市转基因食品都是安全，全世界数亿人食用后没有出现一例转基因食品中毒或医疗事故。植物基因工程技术及应用专家讲座第48页（六）转基因植物商业化中存在问题1.转基因性状失效问题。这种失效来自于两个方面，首先是所转基因本身表示缄默或表示强度降低；另首先是病虫草等对转基因性状产生抗性，从而对转基因植物商业化带来不利影响；2.转基因作物产量品责问题。1994年底一个在美国同意商品化转基因迟熟番茄上市之后，并没有像人每逾期得那样有效，所以在1997年就推出了市场。其原因是这种番茄产量偏低而经不起采收、包装及运输等整个过程，很多番茄在运抵目标地是已经软化或碰伤、失去了市场价值。3.经济地理问题。对不一样发展水平国家来说，转基因作物商业化主要问题有一定差异。如欧盟转基因作物商业化主要是政府和公众对转基因作物认识问题，而对贫穷发展中国家则可能是经济问题。4.次要病虫害问题，因为转基因性状只是对个别性状抗性，可能引发其它病虫害逐步演变成主要病害。植物基因工程技术及应用专家讲座第49页（七）转基因技术应用自１９８３年首例转基因植物--烟草问世，年3月全球已经有１２０各种植物取得转基因植株。美国是世界上第一个同意转基因农作物商业化种植国家，其转基因作物种植面积一直居世界首位。２０００年美国转基因作物种植面积达３０３０万公顷，占世界转基因作物种植面积６８％。

当前，最主要转基因作物是大豆和玉米，这两种作物种植面积大约占全球转基因作物总面积８０％。其中转基因大豆占全球转基因作物面积约６０％，转基因棉花和油菜种植面积位居第三和第四。

转基因作物给人类带来了巨大经济效益。植物基因工程技术及应用专家讲座第50页

自1983年首次取得转基因烟草、马铃薯以来，在短短十余年间，转基因作物研究和开发进展十分快速。至年国际上已取得转基因植株植物已经有超出35个科120多

，其中“第一代”农业生物技术产品已进入研究开发实用阶段，“第二代”转基因产品也基本上成形。研究方向抗病毒方面抗虫害方面改良品质方面抗逆境方面抗除草剂方面医疗保健方面提升产量方面第一代第二代植物基因工程技术及应用专家讲座第51页1.1抗病毒方面烟草花叶病毒外壳蛋白基因+普通番茄抗烟草花叶病毒番茄继抗烟草花叶病毒番茄培育成功之后，抗黄瓜花叶病毒转基因植株也陆续取得成功。我国科学家利用转基因方法，培育出了抗病毒烟草、抗病毒甜椒和抗病毒番茄，而且已进行了田间试验，并被同意进行商品化生产。植物基因工程技术及应用专家讲座第52页1.2抗虫害方面试验已证实，假如将苏云金杆菌杀虫蛋白与蛋白酶抑制剂配合使用，可提升杀虫2～20倍，效果更佳。能够预料，未来发展趋势是将两类基因同时转入植物，以提升抗虫能力。植物基因工程技术及应用专家讲座第53页1.3抗除草剂方面有资料报道：农业上因杂草危害减产由40年代8%上升为12%。而我们广泛使用除草剂大部分为非选择性除草剂。所以只能在作物播种前使用。而经过基因工程培育出了抗除草剂作物，不但能够降低化学除草剂施用量，而且降低环境污染，还能够对轮作或兼作作物选择给予更大灵活性。当前已取得转基因耐除草剂作物有大豆、棉花（棉田面积８０％以上都是转基因抗虫棉

）、玉米、油菜、马铃薯、甜菜等，大多已进入了实用阶段。美国孟山都企业已经在河北和安徽建立了转基因抗虫棉合资企业，凭借其强大技术优势和资本优势与我国抗虫棉企业进行竞争植物基因工程技术及应用专家讲座第54页1.4提升产量方面

“超级水稻”——在水稻基因中插入玉米高光效基因，从而使水稻拥有更高速度光合作用，使大米产量提升了35%。这项工程是由我国首先完成。

一个转谷氨酸脱氢酶基因玉米，因为它能够大大提升对氮肥利用率，所以其产量提升了10%。植物基因工程技术及应用专家讲座第55页1.5改良品质方面一个被称作“金水稻”转基因品种（孟山都等企业开发），能够使食用者防止维生素A缺乏症。因为这种水稻经过转基因后高含胡萝卜素，人体能够将胡萝卜素转化为维生素A。再如，美国生物技术研究人员把月桂树基因导入油菜中，生产出含月桂酸油达40％油菜籽，大大降低了成本并增加了产量。植物基因工程技术及应用专家讲座第56页1.6医疗保健方面年，我国报道一个“抗乙肝西红柿”在中国农科院生物技术研究中心培育成功，又被称为“口服疫苗”。当前，在转基因植物中已表示口服疫苗除乙肝病毒疫苗外，还有霍乱弧菌疫苗、肺结核疫苗、产肠毒素大肠杆菌疫苗、狂犬病毒疫苗、轮状病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗等。生产出口服疫苗转基因作物有番茄、黄瓜、香蕉，还有马铃薯、烟草等。植物基因工程技术及应用专家讲座第57页1.7抗逆境方面针对旱、涝、盐碱、低温等不良因子而培育各类抗逆作物也是