新技术在医学实验中的应用专家讲座

姜启晓Nov14,新技术在医学试验中应用新技术在医学实验中的应用第1页内容提要一试验方法介绍检测蛋白表示水平方法：Westernblot,2D-gel,免疫共沉淀，Shotgun，免疫组化，流式细胞测定，激光扫描共聚焦显微，绿荧光蛋白标识法，萤光素酶标识法，ELISA.检测DNA/RNA表示水平方法：Southernblot,Northernblot,原位杂交,PCR.基因操作方法:基因敲除，基因缄默.新技术在医学实验中的应用第2页内容提要二实用技术介绍细胞活性检测：MTT,MTS，CCK-8,Calcein-AM.细胞凋亡检测：Westernblot,流式，TUNEL,Hoechst33258，DNAladder.活性氧自由基（ROS）检测：DCF,SOD,GSH,ESR.新技术在医学实验中的应用第3页Westernblot原理：Westernblot利用了蛋白质理化性质。在一定pH缓冲液中，特定蛋白质含有固定电荷数。在电场作用下，蛋白质将按电荷数及蛋白质分子量大小在凝胶中分布。SDS法Westernblot深入简化，SDS应用使得全部蛋白都带均匀负电荷，此时蛋白电泳距离只与蛋白分子量大小相关。

新技术在医学实验中的应用第4页Westernblot原理：凝胶是由聚丙烯酰胺组成，聚丙烯酰胺浓度决定了胶中孔径大小，孔径越大，蛋白运动越轻易，越快，对大分子量蛋白分离效果好。反之亦然。测定大分子量蛋白（>１００ＫＤ）时宜用低浓度胶，测定小分子量蛋白（<３０ＫＤ）时宜用高浓度胶。另有梯度胶（比如４－１５％），能够确保在一定范围内蛋白都相对均匀分离。新技术在医学实验中的应用第5页转膜方法主要分为湿转(Wettransfer)和半干转（Semi-drytransfer）。湿转速度较慢，操作难度较大，易出现气泡，但转膜效率高，尤其对大分子量蛋白效果好。半干转特点与湿转恰好相反，对大分子量蛋白轻易转不上。依据实际情况选择。新技术在医学实验中的应用第6页新技术在医学实验中的应用第7页Westernblot电泳完成后，蛋白质被转移到固相载体（NC膜或者PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离多肽类型及其生物学活性不变。膜上非特异性结合位点需使用脱脂牛奶等封闭，以固相载体上蛋白质或多肽作为抗原，与对应抗体起免疫反应，再与酶,同位素或者荧光标识第二抗体起反应，经过底物显色,放射自显影或荧光成像以检测电泳分离特异性目标基因表示蛋白成份。新技术在医学实验中的应用第8页示例试验步骤：①蛋白质抽提

②蛋白浓度测定：按试剂盒说明书，用BCA法测定蛋白浓度。③变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)：玻璃板夹槽中依次加入分离胶和浓缩胶，待其凝固；依据浓度取适量待测蛋白与5x上样缓冲液混匀后,95度变性10分钟,加入上样孔中，浸于电泳缓冲液，以75V（浓缩胶）及120V（分离胶）恒压电泳。④转膜：裁切与凝胶一样大小NC膜和滤纸，NC膜置于转膜缓冲液中浸泡30min以上。按次序依次放置滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，半干法以40mA恒流转膜2h。新技术在医学实验中的应用第9页⑤抗原抗体反应:蛋白质以脱脂牛奶封闭1h后，与一抗4℃孵育过夜，与二抗室温孵育1h，TBST洗涤4次，每次5min。⑥显色:加入DAB显色5min，蒸馏水洗终止显色。凝胶分析软件Quantityone测灰度值。

显色系统各种多样。传统二抗通常是与辣根过氧化酶结合抗体，遇DAB显色或者与专用试剂盒试剂反应使胶片曝光。新型二抗与荧光物质结合，在专用荧光成像仪下读取荧光印迹，能够方便地进行多通道westernblot(multiplexwesternblotting),免去切膜或者抗体去除步骤.新技术在医学实验中的应用第10页2D-Gel新技术在医学实验中的应用第11页免疫共沉淀是一个着重检测蛋白-蛋白或蛋白-核酸间联络方法。基本原理是利用抗原抗体结合,以及与抗体相连小珠（Beads）,以物理方式将目标蛋白连同与其相结合物质分离出来单独分析。分离后，解离蛋白，以Westernblot方式检测潜在目标水平，即可得知目标间在细胞中是否有紧密联络。新技术在医学实验中的应用第12页免疫共沉淀新技术在医学实验中的应用第13页Chromatinimmunoprecipitation（CHIP）染色质免疫沉淀，与蛋白共沉淀相同，不一样之处是利用甲醛等产生DNA与其上蛋白质交联，从而用带小珠抗体将蛋白质与DNA一起“拉下”，用PCR检测拉下DNA.新技术在医学实验中的应用第14页“猎枪”法（Shotgunproteomic）新技术在医学实验中的应用第15页免疫组化

Immunohistochemistry原理类似Westernblot，但直接在组织切片（或在满足一定条件情况下，整个组织）上进行，保留了原始组织结构，能提供更多信息。缺点：费时，目标蛋白表示不高时不易检测到，量化统计不易。新技术在医学实验中的应用第16页新技术在医学实验中的应用第17页新技术在医学实验中的应用第18页免疫组化样本制备通常来讲，免疫组化用样本为组织切片（几微米厚）.足够小且能被完全通透化（Permeabilize)组织能够直接做在位免疫组化，但应用不如原位杂交来得广泛。冷冻切片信号很好，但受时间，地点，存放条件等限制。石蜡切片含有储存，使用方便等优点，但需要抗原修复方可进行免疫组化染色，且效果普通差于冷冻切片。新技术在医学实验中的应用第19页免疫组化抗体使用免疫组化中使用一抗通常与Westernblot中用相同。二抗被设计成与一抗宿主结合抗体，普通结合有探测用分子，免疫组化中惯用是生物素（biotin）。一抗宿主普通不能与试验所用组织同种，但必要时也有专用试剂能够允许这种应用例子：MOM（MouseonMouse)Kit。新技术在医学实验中的应用第20页不一样探测方法直接探测法：直接标识一抗，不需使用二抗来探测目标蛋白表示水平，最简单但敏感度最差，基本已不用。间接探测法：一抗没有标识，然后用抗一抗二抗来间接探测目标蛋白表示水平。有信号放大作用，敏感度好，节约试剂。新技术在医学实验中的应用第21页间接探测法介绍：PAP法PAP:peroxidaseanti-peroxidasemethod

PAP法使用未标识一抗和二抗，之后加入第三层探针：peroxidase及其抗体，且抗体抗原性与一抗相同，都与二抗相结合。如此以二抗为中心形成“三明治”结构。

新技术在医学实验中的应用第22页Avidin-BiotinComplex(ABC)法免疫组化最惯用方法之一。也是形成“三明治”样结构，使用未标识一抗，生物素（biotin）标识二抗，生物素标识peroxidase以及生物素结合蛋白（Avidin）。需要封闭内源性

peroxidase。必要时，封闭内源性

biotin。新技术在医学实验中的应用第23页LabeledStreptavidinBiotin(LSAB)法

与ABC法相同，但使用Strptavidin替换普通生物素结合蛋白，其与组织非特异性结合较少，所以能够降低背景。新技术在医学实验中的应用第24页新技术在医学实验中的应用第25页免疫组化中注意关键点样本准备封闭（非特异性蛋白质结合位点，内源性peroxidase，内源性biotin）抗体浓度培养温度显色时间新技术在医学实验中的应用第26页流式细胞仪1试验原理:

流式细胞仪(FlowCytometer)是采取流式细胞技术对细胞或颗粒悬液进行快速分析自动化分析仪器。流式细胞术（FlowCytometry)是上世纪70年代发展起来一项新技术。它经过对流动液体中排成单列细胞或颗粒进行逐一分析、测定细胞或颗粒光散射和荧光情况，以取得其大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理或化学特征。要求细胞悬浮在培养基中。对于贴壁细胞，需要先将其游离出来，有一定损伤。

新技术在医学实验中的应用第27页流式细胞仪应用举例细胞凋亡、死亡检测-AnnexinV/PI双染色法1原理细胞凋亡早期生化特征之一是氨基磷脂转移酶活性降低使磷脂酰丝氨酸(Phosphatdylserine)“翻到”细胞膜外层。荧光标识AnnexinV-FITC(AV)和碘化丙啶(propidumiodide,PI)双染可区分细胞凋亡和坏死,对AV和PI均不染色是正常细胞,对AV染色对PI不染色为早期凋亡细胞,对AV和PI均染色为晚期凋亡细胞或坏死细胞。2结果判断凋亡细胞对全部用于细胞活性判定染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤细胞DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好细胞则不会有红色荧光产生。所以，在细胞凋亡早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相同。在双变量流式细胞仪散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。新技术在医学实验中的应用第28页新技术在医学实验中的应用第29页

[Ca2+]i检测－Fluo-3-AM荧光染色原理用荧光探针Fluo-3-AM进入细胞后经非特异性酯酶水解为Fluo-3,后者是钙离子螯合剂,与钙离子形成复合物经紫外激发可产生荧光,流式细胞仪经过检测其荧光强度而间接反应胞内游离钙水平。人参皂苷(saponin)降低缺氧心肌细胞中钙超载。Lietal.Thesaponinofredginsengprotectsthecardiacmyocytesagainstischemicinjuryinvitroandinvivo,Phytomedicine,19(6)477-483新技术在医学实验中的应用第30页线粒体膜电位（ΔψМ）测定－rhodanmine123荧光染色原理氧化刺激诱导细胞凋亡可致线粒体两种功效改变:一是线粒体膜电位降低和线粒体通透性孔开放,二是线粒体产生活性氧。线粒体对rhodanmine123摄取依赖其膜电位,分析rhodanmine123荧光强度可反应线粒体膜电位。

Black:control,Purple:UVBmodel,Yellow:UVB+0.25%PCF,Red:UVB+0.5%PCF,Blue:UVB+1%PCF,Green:UVB+0.1%VitC.新技术在医学实验中的应用第31页激光扫描共聚焦显微(ConfocalLaserScanningMicroscopy，CLSM）1基本原理激光共聚焦显微镜是近年来发展起来一个结合激光扫描、计算机自动分析与显微镜技术新技术，新仪器。它采取计算机自动定量分析被激光扫描物体所激发出荧光数量改变，含有图像清楚、特异性高、敏感性强、可准确定量等优点。2优点①激光共聚焦显微镜做间接免疫荧光组化染色并做定量分析，利用激光聚焦／荧光标识和系统软件分析对组织进行深层与断层扫描，不破坏组织细胞结构，可准确深层次定位和准确定量，是转化了准确定量分析。新技术在医学实验中的应用第32页②激光共聚焦显微镜普通都有2个以上不一样波长激光管，所以只要将标本标识上不一样波长荧光，就能够在同一张切片上同时分析2种或更多不一样指标改变，并比较它们之间比值改变，方便而准确。③激光共聚焦显微镜能够依据科研需要，提供纯荧光、白光、以及荧光与白光合成图像等各种图像。④以往免疫荧光染色多要求冰冻新鲜组织标本，如用石蜡切片做免疫荧光染色，在普通荧光显微镜下观察，常因背景非特异性荧光过强而影响观察结果。但如用激光共聚焦显微镜扫描石蜡切片荧光染色，可取得清楚图像。新技术在医学实验中的应用第33页3应用㈠定性定量定位荧光分析:CLSM可对单、双或三色标识细胞及组织标本荧光进行定性定量定位分析，还可测定膜电位和配体结合等生化反应程度。㈡Ca2和pH等细胞内离子实时定量测定:利用Fluo-3、Fura2等荧光探针，CLSM能够测定Ca2在活细胞内浓度改变。CLSM可测定单个或一群细胞内ca2浓度，并提供细胞内Ca2分布二维及至三维图像。另外，假如对细胞施加外部刺激，CLSM就能观察到细胞内各点Ca2

浓度在外部刺激下随时间而产生改变。这对于研究Ca2

等离子细胞内动力学有意义。利用SNAFL类探针可对单个或一群细胞内pH及细胞内pH改变进行测定。使用双荧光探针Fluo一3和CNARF可进行Ca2

和pH同时测定。㈢细胞物理化学动态监测：CLSM可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度及细胞内颗粒数等参数进行自动测定，能对细胞溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞内特异结构含量、组分及分布进行定量、定性、定时及定位测定。新技术在医学实验中的应用第34页㈣药理研究中应用：CLSM可直接观察药品在细胞内亚细胞水平分布，并可了解药品对细胞内结构特殊亲和力及其药品作用，从而推断细胞内药品定位及细胞耐药相关机制，还可了解其在细胞内代谢过程。例CLSM可直接观察扇贝多肽（PCF）在细胞定位。异硫氰酸荧光素（FITC）标识PCF，显微镜下确定PCF作用位点在细胞膜上。图3PCF保护HaCaT细胞最初作用靶点新技术在医学实验中的应用第35页㈤激光显微细胞外科技术：CLSM可将激光作为“光子刀”使用，完成诸如细胞膜瞬间穿孔，线粒体、溶酶体等细胞器烧灼，染色体准确切割和神经元突起切除等一系列细胞外科术。㈥在亚细胞定位研究中应用：经荧光探针标识细胞器，CLSM可探测光敏剂和探针荧光图像，实现对光敏剂在细胞内亚细胞定位，并进行定性和定量分析。㈦在药品抗肿瘤活性研究中应用：利用CLSM观察细胞形态，统计细胞荧光程度，以细胞荧光程度反应DNA含量，从而判断药品抗癌活性。㈧在释药过程研究中应用：因为CLSM实时观察能力，可对控释药品释药过程中药品损耗改变进行观察。4缺点：①不能观察到大部分膜结构特征，尤其是ultrafiltration膜结构。②成像质量与扫描速度一直是一对矛盾。③扫描过程耗时较长，且只能扫描不动微生物，许多活动大型微生物因运动比较猛烈而对成像造成一定影响。④一些荧光染料可能会对一些活体细胞活性造成一定负面影响，所以宜选择适当荧光染料，同时适当地调整激光光强，宜用最弱光对标本进行照射扫描。新技术在医学实验中的应用第36页ReporterAssay为检测特定基因能否在目标生物体内表示及表示水平，Reporterassay常被使用。PromoterTargetGeneReporterGenePromoterTargetGeneProductsReporterProductsEasyDetection新技术在医学实验中的应用第37页绿荧光蛋白标识OsamuShimomura,MartinChalfie及RogerTsien

于年因绿荧光蛋白发觉，获诺贝尔化学奖。

新技术在医学实验中的应用第38页荧光素酶标识新技术在医学实验中的应用第39页直接ELISA:

直接使用酶标识一抗探测固定抗原。最为简单，防止二抗可能交叉反应，但敏感性较差，需要大量昂贵标识抗体。间接ELISA:不直接标识一抗，而是标识抗一抗二抗。信号能够被有效放大，且一抗免疫活性不会受标识影响。但二抗可能发生交叉反应。“三明治”

ELISA:

先在盘中固定一层捕捉抗体（Captureantibody），以之将目标抗原捕捉，之后再使用一层标识探测抗体。两种抗体必须小心选择以防止相互之间反应。此法不需纯化抗原，同时含有极高敏感性和特异性。但反抗原有要求：最少有两个结合位点。竞争性ELISA:

样本和纯化并事先固定目标抗原对标识抗体进行竞争，假如样本中存在目标抗原，最终得到信号就会下降。此法可用于不纯样本，重复性可靠，但敏感性和特异性都较低。ELISA

（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,

酶联免疫吸附试验）新技术在医学实验中的应用第40页ELISA

（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,

酶联免疫吸附试验）新技术在医学实验中的应用第41页酶标仪1原理

酶标仪（MicroplateReader）是对用专用反应盘进行，建立在吸光度改变基础上各种试验进行读取设备，因其主要用途之一是读取酶联免疫吸附试验结果而得名。但其也可读取其它试验结果，如蛋白定量，各种酶活性检测，MTT等。新式酶标仪除读取普通吸光度外，还能够读取荧光数据：试验者指定激发光波长及放射光波长，带荧光读取功效酶标仪即可读取该数据。同时还有酶标仪带加温，振荡，定时重复读取等等功效，极大地方便了试验。新技术在医学实验中的应用第42页SouthernBlotting新技术在医学实验中的应用第43页EdwinSouthern,SouthernBlotting创造者。左图为他在Nature上关于SouthernBlotting文章中例图。新技术在医学实验中的应用第44页NorthernBlotting新技术在医学实验中的应用第45页Insituhybridization(原位杂交技术)1原理原位杂交本质就是在一定温度和离子浓度下，使含有特异序列单链探针经过碱基互补规则与组织细胞内待测核酸复性结合而使得组织细胞中特异性核酸得到定位，并经过探针上所标识检测系统将其在核酸原有位置上显示出来。

新技术在医学实验中的应用第46页新技术在医学实验中的应用第47页举例：原位杂交检测p21mRNA将用DEPC处理后无菌盖玻片（细胞飞片）置入6孔培养板中，接种细胞于孔内，37℃、5%CO2培养至细胞80％融合，处理同1.2细胞培养。将细胞飞片用中性树胶粘于载玻片上，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗5min×2次，系列酒精脱水。蛋白酶K消化细胞，经PBS清洗，多聚甲醛固定及酒精系列脱水后于37℃用不含探针杂交液预杂交45min。加入含探针90g·L-1杂交液，置于密闭湿盒中，60℃过夜。杂交结束后，NBT显色，中性树胶封片。新技术在医学实验中的应用第48页新技术在医学实验中的应用第49页PCR(PolymeraseChainReaction)聚合酶链式反应，是研究工作中最惯用到技术之一。新技术在医学实验中的应用第50页TaqDNA聚合酶在黄石国家公园沸泉耐热细菌中发觉并分离，在72摄氏度下可正常反应，高达95摄氏度情况下仍不变性，是PCR反应得以进行基础。当代技术已经在此基础上发展出各种改良型耐高温DNA聚合酶，使反应效率提升，反应条件要求降低。新技术在医学实验中的应用第51页PCR条件DNA聚合酶。反应所需模板（Template），DNA分子。反应所需引物（Primer），两个方向。反应所需原料（dNTPs）。适宜缓冲液。适宜反应温度。Real-timePCR还需要荧光染料。当前很多试剂厂商以“MasterMix”形式提供PCR试剂，极大地方便了试验。新技术在医学实验中的应用第52页PCR分类以DNA为起始点PCR（目标为大量复制扩增目标基因）。以RNA为起始点PCR（RT-PCR，目标为检测目标基因表示强度），其又可分为普通RT-PCR和Real-timeRT-PCR。新技术在医学实验中的应用第53页RT-PCR普通步骤1.RNA抽提经典方法是利用RNA在酒精中溶解度低使之析出。较新RNA抽提试剂盒在此基础上利用了能特异性与RNA结合微型分离柱，大大提升RNA产率和纯度。2.检测RNA质量和浓度比色法检测OD260/280和OD260/230，前者在DNA应该为1.8而RNA应该为2左右，后者应该在2.0-2.2左右.

Nanodrop仪器可用极小量样本作快捷而相对准确检测。新技术在医学实验中的应用第54页RT-PCR普通步骤3.逆转录。普通应用试剂盒进行，将逆转录酶，mRNA逆转录引物及对应原料，缓冲液等与抽提到RNA混合，在适宜温度下，从RNA逆转录得到cDNA。4.PCR反应。将PCR各原料，引物及模板混合后，在PCR仪上进行反应。如为普通RT-PCR，反应结束后取产物电泳，EB染色后凝胶成像分析，如为Real-timePCR，反应结束后直接取数据分析即可。新技术在医学实验中的应用第55页半定量RT-PCR直接完成指定周期数PCR反应后，以电泳及EB染色法确定终产物量。优点：不需尤其试剂和仪器，成本低廉。缺点：检测敏感度较差，试验步骤较繁琐，且包括有毒试剂EB使用。新技术在医学实验中的应用第56页Real-TimePCR借助与双链DNA特异性结合发出荧光特殊染料（如SYBRGreen），在每一个PCR周期完成后都读取一次产物量，能够得到实时PCR产物扩增数量并较准确地定量分析。优点：反应敏感度好，CT(Cyclethreshold)值测定防止了非线性扩增对结果干扰。缺点：需要专用PCR仪器，器材及试剂价格较昂贵。新技术在医学实验中的应用第57页Real-TimePCR示例注意在使用SYBRGreen为基础Real-timePCR时要检测熔化曲线以确定得到是单一产物。新技术在医学实验中的应用第58页PCR易出现问题产物错误：引物设计不佳/结合温度有误/存在污染/镁离子浓度不妥。无产物：引物设计不妥或引物数量不足/存在干扰反应物质/污染/试验方法或设备问题。多重产物：结合温度设置太低/镁离子浓度不妥/引物过多或生成引物二聚体/外来DNA污染。新技术在医学实验中的应用第59页多重产物及处理实例左上为多重产物实例。能够看到即使只加入一个引物，此反应却生成了两种产物。调整试验条件（主要是结合温度）后，同一反应得到均一产物。新技术在医学实验中的应用第60页Microarray新技术在医学实验中的应用第61页基因敲除经典基因敲除法（Knockout），将目标基因替换为一个外源性基因（惯用耐新霉素基因以方便筛选细胞），从而敲除目标基因。相对来讲，经典基因敲除法较为简单。但有一些不足之处，如有基因敲除就无法让动物生存，有会被代偿等。新技术在医学实验中的应用第62页条件敲除（ConditionalKnockout）普通是靠Cre-LoxP/FLP-Frt重组系统来完成，目标基因上被加入LoxP或Frt元素，带有LoxP小鼠与在一些组织上特异性表示Cre（或者Flp）小鼠交配，后代特定器官上该基因即被敲除。易造成错位翻译。新技术在医学实验中的应用第63页四环素控制条件基因表示/缄默：转录激活子（Transactivator）rTA，在无四环素存在前提下，能与一个尤其定制操纵子tet-O结合，激活下游目标基因表示，而四环素（如多西环素）应用将使此激活子与四环素结合，快速中止目标基因表示。新技术在医学实验中的应用第64页RNA干扰1原理：

近年来研究表明，将与mRNA对应正义RNA和反义RNA组成双链RNA(dsRNA)导入细胞，能够使mRNA发生特异性降解，造成其对应基因缄默。这种转录后基因缄默机制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。2小干涉RNA（siRNA）：

是在RNA干涉过程中人工体外合成小片段RNA，由19-21个碱基正确关键部分和每条链上2个悬挂核苷酸组成。3应用：

①研究信号传导通路和基因功效

RNAi能够在哺乳动物中降低特异性基因表示，制作各种表型，而且抑制基因表示时间，控制基因表示部位。

②开展基因治疗新路径

一基因家族多个基因含有一段同源性很高保守序列这一特征，设计针对这一区段序列dsRNA分子，只注射一个dsRNA即能够产生多个基因表示同时降低表现，也可同时注射各种dsRNA而将多个序列不相关基因同时剔除。为治疗多基因调控肿瘤疾病，带来新治疗策略。

新技术在医学实验中的应用第65页新技术在医学实验中的应用第66页Fas干扰试验设计空白对照组、UVB模型组、UVB＋试剂对照组

(不加siRNA,仅加入转染试剂)、UVB＋siRNA组接种细胞至6孔板让其在有血清无抗生素培养基中生长，使得转染时细胞融合度达60%～80%

转染siRNA组每孔加入800μL转染复合物[8μLsiRNA溶于100μL转染培养基＋8μLsiRNA转染试剂溶于100μL转染培养基]新技术在医学实验中的应用第67页37℃、5%CO2孵育5－7h去除转染复合物，更换含10%小牛血清正常培养基37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育18－24h转染48h后进行UVB照射30min干扰效率检测

RT-PCR干扰后FasmRNA表示检测水平

Westernblot检测干扰后Fas蛋白表示水平新技术在医学实验中的应用第68页惯用试验技术介绍新技术在医学实验中的应用第69页细胞活性（CellViability）检测检测样本中活细胞相对数量。最为惯用试验伎俩之一，在抑瘤，毒理，细胞保护等试验中都必不可少。MTTMTSCCK8Calcein-AM染色PI染色TrypanBlue染色新技术在医学实验中的应用第70页MTT法MTT，化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名是噻唑盐。活细胞，尤其是增殖细胞中能量代谢旺盛，其中线粒体能量代谢过程中产生琥珀酸脱氢酶可将淡黄色MTT还原为蓝色结晶formazan沉积在细胞内和细胞周围，形成结晶与增殖细胞数成正比。二甲基亚砜（DMSO）可溶解formazan，用酶联免疫检测仪在490nm波优点测定其光吸收值，可间接反应细胞数量。经典方法，缺点是较麻烦，误差相对也较大。新技术在医学实验中的应用第71页

MTT改进型：MTSMTS是在MTT基础上加以改进一个四唑盐，Promega企业将其与电子偶联剂PES稳定混合，形成单一溶液形式，易用而稳定细胞活力检测试剂。新技术在医学实验中的应用第72页CCK-8法CCK-8（CellCountingKit-8），是碧云天企业推出另一个MTT改进型，基于MTT另一个衍生物WST-8，与MTS法相同，只需将单一溶液加入即可测定活细胞相对数量。新技术在医学实验中的应用第73页Calcein-AM染色

Calcein-AM是一个荧光染料Calcein前体，能穿透细胞膜，在活细胞中被转化为Calcein，荧光强度与活细胞数量成正比。可用于荧光显微镜下标识细胞。新技术在医学实验中的应用第74页PI染色法PropidiumIodide(PI)为DNA嵌入剂（Intercalator），同时为一荧光染料。PI特征是无法穿过活细胞膜，所以其能被用来确定死细胞。前面流式细胞术已经介绍过经过PI染色确定细胞是否死亡方法。新技术在医学实验中的应用第75页TrypanBlue染色法TrypanBlue(台盼蓝）也是一个只能染色死细胞染料，与PI不一样之处是其染色肉眼可见，可给出直观细胞生存是否表述。新技术在医学实验中的应用第76页细胞凋亡检测Westernblot流式细胞术TUNELHoechst33258染色DNAladder新技术在医学实验中的应用第77页细胞凋亡信号通路新技术在医学实验中的应用第78页Westernblot检测细胞凋亡需要同时检测两个目标：Caspase-3及PARP（PolyADP-RibosePolymerase）Caspase-3在正常细胞中以前体酶（Procaspase-3）形式存在，约为32KD。凋亡发生时，前体酶被剪切为含有活性Caspase-3，两个亚基分别约为17KD和

12KD（分子量随不一样物种有少许波动）新技术在医学实验中的应用第79页PARP是一个DNA修复酶，是激活caspase-3底物。正常全长PARP为116KD,被caspase-3剪切后则被分为89KD和24KD两段。新技术在医学实验中的应用第80页流式细胞术法检测凋亡在流式细胞术一节已经讲到，以AnnexinV/PI双染色法结合流式细胞仪即可分辨正常活细胞，早期凋亡细胞及晚期凋亡/坏死细胞。新技术在医学实验中的应用第81页TUNELTerminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPnickendlabeling。末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸切口末端标识。基于Terminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT)应用。凋亡发生时，DNA被切断，暴露残端能够被TdT识别，进而将dNTP联接到DNA残端上。经过标识dNTP，凋亡细胞能够被在位标识出来。新技术在医学实验中的应用第82页TdT只识别凋亡时产生DNA断裂，而不会识别其它原因如辐射造成DNA断裂，故可特异性显示凋亡细胞。惯用Biotin-Streptavidin-HRP系统（与免疫组化相仿）显色。注意需要阻断内源性过氧化酶，biotin高表示组织还需要阻断内源性biotin。新技术在医学实验中的应用第83页Kumar

etal.

CardiovascularDiabetology

6:34新技术在医学实验中的应用第84页Hoechst33258荧光染色1原理：细胞凋亡形态学表现为染色质固缩。Hoechst33258染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞细胞核呈正常蓝色，而凋亡细胞细胞核会呈致密浓染或呈碎块致密浓染，颜色有些发白。2步骤：

①细胞种入放洁净盖玻片六孔板内，待细胞融合至80~90%。

②外界刺激细胞发生凋亡（紫外线照射）

③Hoechst33258染色