厌氧菌的分离和鉴定

厌氧菌分离与判定卫生部北京医院陈东科厌氧菌的分离和鉴定第1页

厌氧菌检验是临床微生物检验主要组成部分。在无氧（或少氧）条件下，或氧化还原电势低条件下才能繁殖细菌称为厌氧菌。因为厌氧菌在人体肠道、口腔、泌尿生殖道正常菌群中占优势，所以当人体菌群失调时，厌氧菌可能侵犯人体许多部位，发生严重甚至致死内源性厌氧菌感染。厌氧菌感染常发生在深部伤口,但也可伴兼性厌氧菌和需氧菌侵犯人体任何器官和组织。所以，对厌氧菌检验应给予高度重视。厌氧菌的分离和鉴定第2页

人体各部位厌氧菌寄生量及其与需氧菌之比__________________________________________________________厌氧菌数量眼结膜鼻涕唾液牙表面牙周袋与牙垢

__________________________________________________________（cfu\g）103~4101~4108~9109~101011~12

厌氧菌与

需氧菌之比10:110:18~10:11:11000:1

__________________________________________________________厌氧菌数量胃液结肠小肠阴道外尿道皮肤

__________________________________________________________（cfu\g）102~51011~12104~6108~9103~5103~4

厌氧菌与

需氧菌之比1:11000:11:110:110:110:1__________________________________________________________厌氧菌的分离和鉴定第3页1.正确地选择标本以下细菌学指征有利于选择标本做厌氧培养：

（1）深部伤口或软组织脓肿脓，尤其是伴有恶臭或含有硫磺颗粒时。

（2）可疑为气性坏疽或少见严重产气或坏死性感染所取得坏死组织或病灶去除材料。

（3）粘膜部位感染灶取得材料。

（4）从脑、肺、肝或其它器官脓肿或从腹腔内、肛周、隔下或其它部位脓肿取得材料。厌氧菌的分离和鉴定第4页

（5）无菌区感染灶吸出液(包含血液、脑脊液、腹水、胸水、滑膜液、羊水等)。

（6）人或动物咬伤感染灶取得材料。

（7）变黑或置于紫外线发红色荧光渗出物。

（8）革兰染色，镜下见到含有厌氧菌独特形态材料。

（9）可疑引发肉毒杆菌食物中毒食物。厌氧菌的分离和鉴定第5页2.正确地搜集标本厌氧菌是人体许多部位（如皮肤、口咽部、肠道和泌尿生殖道）正常菌群中一部分，所以以下材料无需做厌氧培养：

（1）咽、鼻、尿道或直肠拭子。

（2）咳出痰，经过支气管镜取分泌物，排出或导出尿、粪及胃内容物。厌氧菌的分离和鉴定第6页

为排除或尽可能降低正常菌群中厌氧菌污染，用注射器抽取标本比用拭子更加好，尤其适合用于以下临床情况：

（1）从未开放脓肿抽取脓液。

（2）经过胸腔穿刺抽出胸腔液。

（3）从耻骨联合上方做膀胱穿刺吸出或从肾造口管搜集尿。

（4）气管切开吸收肺分泌物。厌氧菌的分离和鉴定第7页

（5）穿刺抽出腹腔液。

（6）经过腰椎穿刺抽出脑脊液。

（7）窦道标本可插入小导管用注射器吸出，注射器和针头内气体应全部排出，将其内容物直接注入一个已排出气无菌试管内。也可自窦道损伤部位取材做活组织检验。假如必须使用拭子，应尽快接种于适宜培养基中。厌氧菌的分离和鉴定第8页

3.正确地运输标本临床标本一旦离开人体部位，在进入厌氧环境前，必须预防大气中氧毒性作用。应及时将取材拭子、塑料导管内少许液体、吸入注射器标本装入厌氧生物袋或管，在运输过程中要保持厌氧状态。培养基内不应含有肝素，因它会抑制细菌生长。厌氧菌的分离和鉴定第9页

4.使用新配制培养基初代接种厌氧菌最好使用新配制培养基。

平板培养基无需在厌氧条件下贮存，用前可进行预还原，但厌氧条件下贮存可延长培养基使用期。厌氧菌的分离和鉴定第10页

5.提供可靠厌氧环境使用厌氧罐法、厌氧袋法或厌氧箱法。在厌氧培养中必须使用氧化还原指示剂，普通采取亚甲基美兰或刃天青，每次要新鲜配制。假如能在孵育整个过程中维持厌氧条件，指示剂溶液将无色，不然指示剂则变色。厌氧菌的分离和鉴定第11页厌氧菌的分离和鉴定第12页厌氧菌的分离和鉴定第13页厌氧菌的分离和鉴定第14页厌氧菌的分离和鉴定第15页6.标本接种与孵育

（1）拭子和液体标本直接接种固体和液体培养基（需氧和厌氧培养各一份），在厌氧平板上贴一片灭滴灵纸片（5μg/片），置35℃培养。同时做直接涂片革兰染色镜检。用铂-铱合金环（不用镍-铬合金环，因为它可氧化接种物）三区划线接种平板，以确保长出单个菌落。（2）若被检标本是组织块，则立刻将其移入无菌组织研磨器内，用硫乙醇酸盐混合研碎，最好在厌氧箱内或无氧条件下操作。组织匀浆接种同液体标本。（3）可疑含有芽胞梭菌标本，还要用乙醇或加热处理后再行接种。厌氧菌的分离和鉴定第16页7.直接涂片检验当有足够标本或收到两个拭子时，最好在接种前做涂片革兰染色镜检，检验结果可提醒需要接种哪些培养基（非常规使用）。涂片检验可看出有没有细菌，微生物类型和大约数量以及芽胞、形状和位置（芽胞梭菌）、着色情况及菌体特征。对血性液体或浓稠分泌物用丫啶橙染色比革兰染色较易观察。这些初步结果应该及时向主管医生汇报，以帮助他们正确选取抗菌药品。涂片检验可查对培养结果是试验室质量控制一个主要指标。厌氧菌的分离和鉴定第17页8.厌氧菌判定（1）灭滴灵纸片周围出现抑菌环说明有厌氧菌生长（绝大多数专性厌氧菌对灭滴灵敏感，兼性厌氧菌耐药）。（2）耐氧试验：接种BRBA平板（需氧厌氧各放一块）及巧克力平板（置CO2条件下）。（3）革兰染色：依据菌落和菌体形态、染色特征可初步判定。（4）抗生素敏感性判定：BRBA平板上分区划线接种，第一划线区贴多粘菌素（10μg/片）、卡那霉素（1000μg/片）和万古霉素（5μg/片）。厌氧菌纯培养抑菌环直径>=10mm为敏感。厌氧菌的分离和鉴定第18页表1Ⅱ级水平试验室革兰阴性厌氧菌群、属、种判定_________________________________________________________________________________厌氧菌种类细胞卡那万古多粘20%靛基质脂酶硝酸盐尿素酶动力凹痕砖红色形态霉素霉素菌素胆汁还原荧光_________________________________________________________________________________脆弱类杆菌群BRRR+V——其它类杆菌BRRV—V——+—产色素杆菌.RVV—VVP.中间型杆菌CB/BRRS—++-+-PloescheiiRRV———+类解脲类杆菌群SRS———+VVV—解脲类杆菌.BSRS——++—V梭状肛菌属SRSVVV—革兰阴性球菌CSRSV韦荣球菌属CSRS+—+_________________________________________________________________________________

R:耐药，S:敏感，V:不定，C:球菌，B:杆菌，CB:球杆菌，P:Prevotella;*甲酸、延胡素酸盐刺激生长阳性

厌氧菌的分离和鉴定第19页表4-3Ⅱ级水平试验室革兰阳性厌氧菌群、属、种判定_______________________________________________________________________________________________________________厌氧菌种类细胞已醇芽卡那多粘万古靛基质硝酸盐触酶卵磷反向CA菌体列车双环β尿素酶形态胞试验霉素菌素霉素还原脂酶MP试验状排列溶血现象_______________________________________________________________________________________________________________厌氧革兰阳性球菌C—VRSV厌氧消化球菌C/CB—RSRS——+V不解糖消化球菌C—SRS+梭状芽胞杆菌属B+VRSV奈格尔试验阳性梭芽胞菌B+SRS+产气荚膜梭菌B+SRS—++++双酶梭菌B+SRS—+————索氏梭菌B+SRS—+———+奈格