病毒的遗传分析

病毒的遗传分析第1页/共48页第一节、病毒概述一、病毒的一般特性与类型1、病毒的一般特性病毒无细胞结构，不属于原核生物，单独一类.病毒没有合成蛋白质外壳所必须的核糖体,所以必须感染活细胞，利用宿主的代谢合成机器、能量和合成核酸与蛋白质的底物，才能合成新的病毒后代。病毒=蛋白质外壳(衣壳)+核酸(DNA或RNA)第2页/共48页烟草花叶病毒腺病毒T4噬菌体艾滋病病毒

RNA

DNA

DAN

RNA第3页/共48页2、病毒的类型病毒按宿主噬菌体植物病毒动物病毒按核酸ss-RNA型ds-RNAss-DNAds-DNA按侵染周期温和型的烈性的按存在状态原病毒（噬菌体）侵染型病毒（噬菌体）第4页/共48页病毒类别核酸类型核酸形状核酸长度类病毒1-RNAO＜0.2kb1.噬菌体：T2、T42-DNAL162.0kbT52-DNAL117.0kb

2-DNAL/O51.9kbP222-DNAL40.5kbT72-DNAL37.5kb

62-RNAL(M)14.1kb

X1741-DNAO5.4kbR17、F2、MS21-RNAL3.0kbL:线状、O:环状、M:基因组含几个片断、1=单链、2=双链第5页/共48页病毒(virus)类别核酸类型形状核酸长度2.植物病毒:创伤肿瘤病毒（WTV）2-RNAL21.0kb

雀麦花叶病毒（BMV）1-RNAL(M)9.0kb

马铃薯X病毒（PVX）1-RNAL8.67kb

花椰菜花叶病毒（CaMV）2-DNAO8.1kb

烟草花叶病毒（TMV）1-RNAL6.3kb

芜菁黄色花叶病毒(TYMV)1-RNAL6.0kb3.动物病毒:鸟痘病毒2-DNAL?300.0kb

牛痘苗病毒2-DNAL240.0kb

疱疹病毒2-DNAL15.9kb

呼肠孤病毒(reovirus)2-RNAL3.4kb

口蹄疫病毒（FMDV）1-RNAL10.3kb

脊髓灰质炎病毒(polio)1-RNAL(M)7.8kb

多瘤病毒(polyoma)2-DNAO4.5kbL:线状、O:环状、M:基因组含几个片断、1=单链、2=双链核酸分子长度与碱基数的关系：3kb=1㎛第6页/共48页

在遗传学研究中使用最为广泛的是噬菌体三大特点：繁殖周期短、易得大群体、基因组小。第7页/共48页第8页/共48页2009年3月起源于墨西哥和美国的甲型H1N1

流感，为A型流感病毒，属于H1N1亚型流感病毒毒株。H1N1为单股RNA病毒，基因组13.6kb，含8个独立的基因片段，分别编码RNA聚合酶PB1，聚合酶PA，PB1-F2和PB2，基质蛋白M1和M2，非结构蛋白NS1和2，核衣壳蛋白NP，凝血酶素HA和神经氨酸NA。第9页/共48页PB2和PA来自于禽的H5N1PB1来自人的H3N2HA,NP和NS来自北美猪的H1N1；NA和MP来自欧洲猪的H1N1第10页/共48页SARS病毒——一种全新的冠状病毒

冠状病毒的遗传物质是一个单一的RNA分子。这种RNA和N蛋白共同组成病毒，有三个结构蛋白，属糖蛋白。冠状病毒的特点是RNA和RNA之间重组率非常高，出现变异正是由于这种很高的重组率。第11页/共48页第12页/共48页禽流感病毒第13页/共48页二、噬菌体的繁殖1、第14页/共48页2、温和噬菌体的侵染周期

温和性噬菌体中λ和P1噬菌体各代表了一种略有不同的溶源性类型温和性噬菌体的生活周期有两个：一个是溶源性周期，即在噬菌体侵入后并不裂解细菌，而是将其DNA分子整合到细菌基因组DNA上，这样的噬菌体叫原噬菌体。带有原噬菌体的细菌叫溶源性细菌。溶源性细菌有两个特点：一是免疫性，二是可诱导另一个是裂解周期，即在有关因素诱导下，原噬菌体基因依次表达，产生大量子代噬菌体，并裂解细菌细胞后释放出来。第15页/共48页λ噬菌体的生活周期

整合到宿主基因组中的原噬菌体仅少数基因活动，表达出阻遏物关闭自身其它基因第16页/共48页P1噬菌体的生活周期第17页/共48页T7噬菌体T7噬菌体的生活周期第18页/共48页三、噬菌体的突变型1、条件致死突变型能够得到的噬菌体突变型有形态突变型（噬菌斑大小、边缘清晰度、透明程度的变化）、寄主范围突变型和条件突变型。条件致死突变型：在某些条件下是致死的。使条件致死突变型噬菌体不能存活或繁殖的条件叫限制条件；条件致死突变型噬菌体能够存活或繁殖的条件叫许可条件。第19页/共48页常见的条件致死突变型有两种：①温度敏感突变：热敏突变→限制条件≥40℃

冷敏突变→较低温度下致死②抑制因子敏感型突变sus:噬菌体发生了无义突变许可条件→宿主菌带有抑制因子（su+）限制条件→宿主菌没有抑制因子（su-）第20页/共48页2、噬菌斑形态和宿主范围的突变型①噬菌斑形态突变型②宿主范围的突变型宿主范围的突变型其本质也是条件致死突变型之一。

T4噬菌体rⅡ突变侵染大肠杆菌B能产生大的噬菌斑，侵染大肠杆菌K是致死的，侵染S产生小的噬菌斑。第21页/共48页

抑制因子敏感型突变sus实质就是无义突变，即编码氨基酸的正常密码子突变成了终止密码:→UAA:赭石突变、→UAG:琥珀突变、→UGA:乳白突变。宿主菌的无义抑制基因su+也是一种突变基因，即携带某个氨基酸的tRNA的反密码子突变成了与一个终止密码互补的特殊反密码子，与噬菌体的无义突变能互补配对，合成正常长度的蛋白质。2、无义突变与无义抑制基因第22页/共48页在不同专一抑制基因宿主菌中sus突变噬菌体的表现噬菌体基因型宿主菌基因型su－su+

琥珀型su+

赭石型su+

乳白型野生型++++sus琥珀型－++－sus赭石型－－+－sus乳白型－－－+第23页/共48页

无义抑制当然也会使其它基因编码的蛋白质变得更长，但正常（野生型）蛋白质仍占多数。5种琥珀抑制基因的性质琥珀型su+插入的氨基酸蛋白质占野生型%su1+丝氨酸28su2+谷氨酰胺14su3+酪氨酸55su4+酪氨酸16su5+赖氨酸5第24页/共48页第二节：噬菌体染色体作图一、噬菌体突变型的两点测验2、由于h–和h+均能感染品系1，用T2的两个亲本h–r+和h+r–同时双重感染品系1,即可得到重组型噬菌体。1噬菌体性状形态宿主范围正常r+突变r-大、边缘清楚小、边缘模糊感染E.coli的菌株不同正常h+

→品系1突变h-

→品系1和2第25页/共48页h-r+

×

h+r-↓品系1h-r+h+r-h-r-h+r+亲型

h-r+

→透明、小重组型

h-r-

→透明、大噬菌斑

h+r-

→半透明、大噬菌斑

h+r+

→半透明、小

重组值=────────×100%(h+r+)+(h-r-)4

种噬菌斑总数第26页/共48页不同速溶菌的突变型在表现型上不同，可分别写成ra-、rb-、rc-等，用rx–h+×rx+h-获得试验结果列于下表：杂交组合各基因型（%）重组值

r-h+

r+h-

r+h+

r-h-Ra-h+×ra+h-34.0

42.012.0

12.024.0/100=24%Rb-h+×rb+h-32.0

56.05.9

6.412.3/100.3=12.3%Rc-h+×rc+h-39.0

59.00.70.9

1.6/99.6=1.6%分别作出ra、rb、rc与h的三个连锁图:第27页/共48页四种可能的基因排列连锁图:再做杂交：rc-rb+

×

rc+rb-↓结果表明:rc–rb的重组值>rb–h∴h位于rb及rc之间，排列顺序→rc–h–rb。由于T2噬菌体的连锁图是环状的，所以2、3排列都对。第28页/共48页二、噬菌体突变型的三点测验Kaiser(1955)最先进行l噬菌体的重组作图。紫外线照射处理获5个l噬菌体突变系,产生不同噬菌斑：

co1系:中央环之外部分表现清亮；co2系:更浓密的中央环第29页/共48页s系:小噬菌斑;mi系:微小噬菌斑;c系:完全清亮;凯泽利用l噬菌体的三突变与野生型进行杂交作图S

co1mi

×

+

+

+第30页/共48页λ噬菌体的基因组遗传图第31页/共48页2、噬菌体突变基因的重组特点1)、两个亲代对子代的遗传贡献很难完全相同两个亲代对子代的遗传贡献，取决于进行双重感染时两个亲代噬菌体各自的用量噬菌体的用量=裂解液的滴度×体积分离群体：亲本型Ⅰ的量≠亲本型Ⅱ的量2)、不能区分子代噬菌体是第一代还是第几代噬菌体在DNA复制以后即进行基因重组。一个受到双重感染的宿主菌细胞内，噬菌体不断地重复着“复制重组”循环，直到噬菌体DNA第32页/共48页被外壳蛋白包装起来为止。一个裂解前的宿主菌单细胞内，就形成了包含所有可能基因型的噬菌体“交配库”（matingpool）。3)、不同基因型噬菌体之间常常发生多次交换4)、提前进行人工裂解可降低基因重组频率用1.0mMKCl处理可使E.coli细胞裂解第33页/共48页第三节：噬菌体基因组与原噬菌体一、噬菌体基因组的一般结构：

48,502bp，线状ds-DNA，两端具有12nt的5`-单链末端(5`-GGGCGGCGACCT-3`)，称为cos末端，可被编码的末端酶所识别，该酶是一个二聚体，由两个基因Nul和A编码的蛋白质组成。第34页/共48页噬菌体的线状ds-DNA进入宿主菌细胞后,两端的cos末端互补配对,断口由DNA连接酶接上,形成环状的ds-DNA。这时12bp的cos末端序列互补区叫cos位点。此后，转录早期表达蛋白，有两个发展方向：1、溶源性反应；2、大量复制→裂解宿主菌第35页/共48页二、噬菌体的生活周期1、DNA的复制与生活周期图示利用两端的cos末端序列进行环化并由连接酶封口利用滚环复制方式进行大量复制逐个在COS位点切开后包装第36页/共48页2、噬菌体生活周期与基因的有序表达

1、最早期转录→产生Ｎ蛋白和cro蛋白，间或止于tR2→产生Ｏ、Ｐ蛋白

2、后早期转录→N蛋白E.coli转录终止因子ρ失活→转录通过tR1、tR2和tL进入其余早期基因区域

3、DNA复制→产生了DNA复制蛋白Ｏ和Ｐ后，双向复制开始，进而进行滚环复制。red

cro

cIIOpOri噬菌体颗粒的形成

头部尾部b2区与存活无关

免疫调控溶源/裂解复制晚期控制裂解AWBCDENu3F1F2ZUVGTHMLKIJ

intxisexo

CIIINcIQSR全长48502

bp

整合、切除与重组NulattAtt为噬菌体附着区第37页/共48页

4、后期转录→cro蛋白与OL和OR结合，阻止RNA聚合酶与PL和PR结合，转录终止。此时控制蛋白Ｑ对P`R起激活作用，导致后期基因转录

5、裂解→后期基因转录产生大量Ｒ和Ｓ编码产物，细菌细胞裂解，噬菌体颗粒释放第38页/共48页三、噬菌体的溶源性反应1、噬菌体的基因组通过att位点整合到细菌染色体E.coli的att位点叫attB，噬菌体的att位点叫attP。attB和attP有一个相同的15bp核心序列。通过缺失实验证明，attP至少要约250bp长，太短将使其功能丧失。attP可绕在整合酶分子的周围，类似核小体的结构。而attB则较短，约23bp长即有功能。attB的序列结构特征：核心序列Ｏ在中间，两侧的序列称为臂，分别是B和B’，记为BOB`序列。Ｏ是attB和attP所共同的。第39页/共48页

attP的序列结构特征也是一样，记为POP`序列。整合酶和IHF在att上都有特定的结合位点。每一次整合的重组过程需要20－40个整合酶分子和约70个IHF分子。说明这两种蛋白不仅仅是酶（起催化作用），而且在形成某种复合物结构中起着重要作用。

第40页/共48页2、DNA的整合与切出噬菌体对裂解途径和溶源途径的选择，取决于宿主菌与噬菌体基因产物间错综复杂的平衡。

cII+cIII→PE→cI和int基因表达

cI产物阻遏或中断所有基因表达，int产物识别attB和attP，并执行“切开—连接”的整合操作。第41页/共48页3、原噬菌体与合子诱导F因子原噬菌体带有原噬菌体的E.coliHfr菌株染色体a+b－c+供体：Hfr+原对噬菌体敏感的E.coliF－菌株染色体a－b+c－受体：F-×a－b+c－a+b－c+a+b－c+a+a+b－c+a－b+c－b－c+a－b+c－a+b－c－c+a－a－b+c－a+b－c+第42页/共48页第五节：环状排列与末端重复１、线性DNA具有环状的遗传图T2、T4噬菌体的DNA：电泳检测、放射自显影→线性分子重组实验→连锁遗传图→环状图2、在线性与环状间转换，需要有末端重复序列。有吗？用DNA外切酶III酶切检验(3`→5`逐个切下单核苷酸第43页/共48页5`GTAGATC——————CACTGAG3`3`CATCTAG——————GTGACTC5`如果没有末端重复序列5`GTAGATC——————CAC3`CATCG3`TAG——————GTGACTC5`AGT5`GTAGATCGTGACTC3`

保温5`GTAGTTC——