植物显微化学制片课件

第五章植物显微化学鉴定法植物显微化学鉴定

利用化学药剂处理植物器官、组织、细胞，通过化学反应在显微镜下直接观测、鉴别细胞壁的组分以及细胞中含有物的性质和分布的一种快速定性及定位方法。植物显微化学鉴定的注意事项

1.选用新鲜而健全的植物材料。

2.取材后要尽快地进行制片。以冰冻切片法或徒手切片法最为适宜。

3.切片厚度约20—40微米。

4.选用的试剂和化学反应方法必须是对某一待测物质具有专一的特殊性。

5.在取样的数量，或观察、测定的次数上都要有重复。尽量排除可能出现的偶然性。6.进行显微化学法鉴定时，应当注意对照试验。

7.反应处理的切片和对照的切片应该尽量邻近，最好是前一片作反应处理，后一片则为对照切片。8.随时将观察的结果用彩色胶卷拍照。多糖显示多糖的高碘酸——希夫反应

基本原理高碘酸破坏多糖分子中的C--C键，变为醛基，醛基与希夫试剂相结合，生成红色的反应产物。这一过程称为PAS反应。

试剂配制：

（1）0.5—0.8％高碘酸水溶液。

（2）洗涤液—偏亚硫酸钾(或钠)溶液10％偏亚硫酸钾5毫升1NHCl5毫升蒸馏水90毫升

临用时将三者混合，使用新鲜混合液。

(3)希夫试剂的配制

1.将1克碱性品红溶于200毫升煮沸的蒸馏水中，摇动5—10分钟，冷却到50℃时过滤。

2.向滤液中加入1N盐酸20毫升，冷却至25℃

。

3.加2克偏亚硫酸钾(或钠盐)，摇匀，静置暗处过夜。

4.加活性炭2克，摇动2—3分钟，用滤纸将溶液过滤于棕色细口瓶中。滤液应该是无色或淡黄色，若呈红色则不能使用。

5.将合格的染液置于黑暗低温(0—4℃)下贮存备用。用前将染液升到室温。

制片程序：(1)切片脱蜡到蒸馏水(2)流水冲洗15—30分钟。(3)0.5-0.8％高碘酸溶液处理10分钟。(4)流水洗涤5—10分钟，蒸馏水过渡。(5)移入希夫试剂中20—30分钟。(6)用偏亚硫酸钾溶液洗三次，每次2—3分钟。(7)流水洗涤10—15分钟，并通过蒸馏水5分钟。(8)按常规通过各级乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。

染色效果表皮皮层中柱淀粉粒脂类物质苏丹Ⅲ溶液，它有二个浓度不同的配方：

A．苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ)0.1克

95％酒精10毫升甘油10毫升

B.苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ)0.01克

95％酒精5毫升甘油5毫升

切片放在上述任一种溶液中染色24小时，然后用50％酒精洗涤，放入甘油中观察，油脂可以染成淡黄或红色。同时为了加速染色，可以微微加热。

木质素

间苯三酚的反应是检验木质化最常用和最简单的方法。操作步骤：

1.将切片放在载玻片中央，滴一滴盐酸浸透(因间苯三酚在酸性环境下才能与木质起作用)。

2.滴上一滴间苯三酚的酒精溶液(5—10％间苯三酚的95％酒精溶液)。观察结果：木质化的细胞壁可现出樱桃红或紫红色。颜色深度决定于细胞壁木质化的程度。此染色法不适于作永久切片，因颜色会慢慢退去而变成淡黄色。

显示DNA的孚尔根反应

原理切片经1NHCl60℃水解处理后，DNA的脱氧戊糖间的醛基成为自由状态。希夫试剂即同暴露出来的醛基发生反应，将核的染色质染成深紫红色。

试剂配制：

(1)1NHCl。

(2)希夫试剂配法见“多糖的高碘酸—希夫反应”。

(3)偏亚硫酸钠水溶液(洗涤液)配方见“多糖的高碘酸一希夫反应”。

制片程序：

(1)组织经卡诺固定液固定4—8小时，固定时间不宜太长，太长会水解DNA，减弱染色强度。(2)切片脱蜡并逐步过渡到蒸馏水。(3)在冷1MHCl中1—2分钟。(4)60℃热1MHCl处理15分钟。(5)用冷1MHCl略洗。(6)蒸馏水漂洗。(7)希夫试剂反应1—2小时(暗处)。

(8)用偏亚硫酸钠水溶液洗三次，每次3—5分钟。(9)流水冲洗15—30分