灵芝孢子油抗肿瘤药效学研究及相关机理探讨

1PAGE1项目名称：灵芝孢子油抗肿瘤药效学研究及相关机理探讨ResearchesontheAntineoplasticPharmacodynamicsandRelativeMechanismsofGanodermaLucidumSporeOil主管单位：流动站名：基础医学二级学科：药理学合作导师：

目录中文摘要 3Abstract 5一.前言 81背景 82计划及目标 16二.博士后期间需要解决的问题及思路 17计划进度及完成情况 18研究内容 19祛邪作用（直接抑制肿瘤细胞生长的作用） 201.灵芝孢子油注射乳剂的急性毒性试验 202.体内抗肿瘤作用——小鼠移植瘤试验 232.1灵芝孢子油注射乳剂iv对S180小鼠肉瘤的抑制作用 232.2灵芝孢子油注射乳剂iv对H22小鼠肝癌的抑制作用 273.体外抗肿瘤试验——灵芝孢子油注射乳剂对体外培养人癌细胞的生长抑制作用 294.体内抗肿瘤作用——人癌裸小鼠移植瘤试验 34灵芝孢子油注射乳剂iv对人胃癌SGC-7901裸小鼠移植瘤的抑制作用灵芝孢子油注射乳剂iv对人卵巢癌HO-8910裸小鼠移植瘤的抑制作用（二）扶正作用（调节机体免疫功能）——灵芝孢子油注射乳剂的扶正作用研究 45对动物免疫功能的影响 451.1对H22荷瘤小鼠体液免疫功能的影响 451.2对正常小鼠体液免疫功能的影响 461.3对H22荷瘤小鼠网状内皮系统(RES)吞噬功能的影响 471.4对正常小鼠网状内皮系统(RES)吞噬功能的影响 491.5对H22荷瘤小鼠特异性细胞免疫功能的影响(DTH试验法) 501.6对正常小鼠延迟性超敏反应的影响(DTH试验法) 51对荷瘤动物生物调节因子的影响——灵芝孢子油注射乳剂对H22荷瘤小鼠生物调节因子的影响 52对荷瘤动物的抗癌作用（见（一）祛邪作用） 53（三）减毒作用——灵芝孢子油注射乳剂对放、化疗毒副反应的减毒作用 541灵芝孢子油注射乳剂iv对H22荷瘤小鼠环磷酰胺(CTX)化疗的减毒作用542灵芝孢子油注射乳剂iv对正常小鼠环磷酰胺(CTX)化疗的减毒作用 543灵芝孢子油注射乳剂iv对H22荷瘤小鼠60Co放疗的减毒作用 554灵芝孢子油注射乳剂iv对正常小鼠60Co放疗的减毒作用 56（四）作用机理的研究 591.灵芝孢子油注射乳剂对肿瘤细胞增殖的影响 592.灵芝孢子油注射乳剂对肿瘤细胞调亡的研究 64（五）其它实验研究（口服灵芝孢子油等系列研究） 731.口服灵芝孢子油的体内抗肿瘤作用（小鼠和裸小鼠模型） 732.口服灵芝孢子油对动物免疫功能的影响 813.口服灵芝孢子油对荷瘤动物生物调节因子的影响 854.口服灵芝孢子油对放、化疗毒副反应的减毒作用 855.康莱特注射液的体内抗肿瘤作用（小鼠及人癌裸小鼠移植瘤实验） 896.口服灵芝孢子油对正常小鼠的免疫调节作用 90五、研究工作总结 104六、讨论 106七、参考文献 109八、博士后期间主要工作内容汇总 113九、缩略语 114十、博士后期间发表论著汇总 117十一、致谢 118灵芝孢子油抗肿瘤药效学研究及相关机理探讨中文摘要灵芝是担子菌纲多孔菌科（Polyproraceae）灵芝属（Ganoderma）真菌的总称，《中国药典》（2021版一部）收载了赤芝Ganodermalucidum(Leyss.ExFr.)Karst．和紫芝GanodermasinenseZhao,XuetZhang。自古以来，灵芝是祖国中医药宝库中的珍品，素有"仙草"之誉。近年来，对灵芝属真菌的化学成分及临床作用的研究颇多，对灵芝的生殖细胞--灵芝孢子药用价值的研究也日益加强,特别是由灵芝孢子提取出来的灵芝孢子油已经成为现代研究的焦点。本课题以灵芝孢子油注射乳剂为主要研究对象，对灵芝孢子油的抗肿瘤药效学及相关机理进行了系统而全面的研究。不仅从离体和整体层面阐述了灵芝孢子油的抗肿瘤药效作用，而且从分子水平深入探讨了其抗肿瘤的作用机理。祛邪作用（直接抑制肿瘤细胞生长的作用）在ICR小鼠移植瘤模型上的实验结果表明，灵芝孢子油注射乳剂（0.25，0.5，1.0g/kg，i.v）对小鼠移植瘤H22（肝癌）和S180（肉瘤）具有确切的抑制作用，肿瘤生长抑制率在40%以上（P<0.05）。在BALB/cA裸小鼠人癌移植瘤模型上的实验结果表明，灵芝孢子油注射乳剂（1g/kg，i.v）均对人胃癌SGC-7901和人卵巢癌HO-8910有确切的抑制作用，相对肿瘤增殖率T/C（%）均在60%以下（P<0.05）。灵芝孢子油注射乳剂对体外培养的SGC-7901，HO-8910，Hu-7等15种人癌细胞具有不同程度的生长抑制作用。扶正作用（增强机体免疫功能的作用）1.灵芝孢子油注射乳剂对动物免疫功能的影响灵芝孢子油注射乳剂（0.25，0.5，1.0g给药可显著提高H22荷瘤和正常小鼠的廓清指数K、吞噬系数α和脾脏系数；灵芝孢子油注射乳剂高、中剂量iv给药可显著提高H22荷瘤和正常小鼠由2,4-二硝基氟苯（DNFB）引起的迟发性过敏反应；灵芝孢子油注射乳剂iv给药对H22荷瘤和正常小鼠血清半数溶血值无显著影响。2.灵芝孢子有注射乳剂对H22荷瘤小鼠生物调节因子的影响灵芝孢子油注射乳剂高剂量(1.0g/kg)iv给药明显提高H22荷瘤小鼠血清IFN-γ水平（P<0.05）。扶正作用实验结果表明，灵芝孢子油注射乳剂可显著增强机体的免疫功能。减毒作用（对放、化疗毒副反应的减毒作用）灵芝孢子油注射乳剂高剂量（1.0g/kg）iv给药可显著对抗由环磷酰胺（CTX）和60Co造成的H22荷瘤和正常小鼠外周血白细胞、骨髓有核细胞数和脾脏系数的下降。减毒实验结果表明，灵芝孢子油注射乳剂对放化疗引起的毒性反应有一定的减毒作用。作用机理的研究用MTT法对灵芝孢子油注射乳剂的作用进行了检测，结果表明灵芝孢子油注射乳剂对各种组织来源的肿瘤细胞的生长具有不同程度的抑制作用。用流式细胞仪和DNALadder的方法检测了灵芝孢子油注射乳剂作用后DNA片段形成，一种细胞凋亡的典型表现。结果灵芝孢子油注射乳剂对能明显抑制细胞增殖的肿瘤细胞发现DNA片段形成，而灵芝孢子油注射乳剂对不能抑制细胞增殖的肿瘤细胞则不出现DNA片段形成。结果表明灵芝孢子油注射乳剂可通过诱导细胞凋亡杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖。灵芝孢子油注射乳剂可以直接抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞调亡，这是灵芝孢子油注射乳剂抗肿瘤作用的机理之一。其它实验研究（口服灵芝孢子油等系列研究，限于篇幅，在此略）关键词：灵芝孢子油，注射乳剂，抗肿瘤，免疫功能，祛邪作用，扶正作用，减毒作用，细胞凋亡.ResearchesontheAntineoplasticPharmacodynamicsandRelativeMechanismsofGanodermaLucidumSporeOilAbstractGanoderma(LingZhiorRenzhiinChinese;SarunoKoshikakeorMannendakeinJapanese),amedicinalmushroom,hasbeenusedextensivelyas“themushroomofimmortality”inChinaandotherAsiancountries.ThismedicinalmushroomishighlyrankedintraditionalChinesemedicineandhasbeenusedasapanaceaformanytypesofchronicdiseases,asdescribed2021yearsagoinShenNung’sHerbal.Thesediseasesincludecancer,neurasthenia,hypertension,typeIIdiabetes,andhepatopathy.Ganodermaisthegenericnameoffungous,whichbelongstoGanodermagenus,Polyproraceae,Bas'diomycetes.ItisreceivedinChinesePharmacopoeia(2021)thatGanodermalucidum(Leyss.ExFr.)Karst．andGanodermasinenseZhao,XuetZhang.Recently,alotofresearchesonthechemicalconstituents,thepharmacologicallyactivenewcompoundsandclinicalusesofGanodermaLucidumhavebeenmade.StudiesonthegermocyteofGanodermaLucidum(spore)arealsoincreaseddramatically,especiallyonsporoderm-brokenGanodermaLucidumSporeOil.FocusedontheGanodermaLucidumSporeOilinjectionemulsion(herenamedHFL,thesamebelow),wehavecarriedoutsystematicandfull-scaleexperimentsontheantineoplasticpharmacodynamicsandmechanismsofGanodermaLucidumSporeOil.Ourgoalsaretoelucidateitsantineoplasticpharmacodynamicsfromexvivoandinvivo,furthermore,tomakedeepinsightsintothemolecularmechanism.Effectoneliminatingpathogenicfactors(Directlyinhibittumorcellsgrowth)Invivoanimalmodels,tumortransplantationinICRmouse，HFL(0.25，0.5，1.0g)showedsignificantinhibitioneffectsinmicebearingtransplantedhepatomaH22andsarcoma180,theinhibitionrateoftumorgrowthallabove40%(P).Onmodelsofhumancancer(humangastriccarcinomaSGC-7901andovariancancerHO-8910,respectively)transplantedintoBALB/cAnudemice,HFL(1g/kg,i.v)bothshowedremarkablyinhibitionactivity,theirrelativetumorgrowthratesallbelow60%(P).ByusingMTTmethod,inexvivoexperimentsofdifferenthumancancercells,suchasSGC-7901，HO-8910，Hu-7,etc15humancancerstrains,HFLhasbeenfounddifferentgrowthinhibitioneffectsondifferentcancercells.Effectonreinforcingthehealthyqi(Enhancethebodyimmunefunction)EffectsonthehostimmunefunctionofnormalandbearingcancermouseHFL（0.25，0.5，1.0g/kg,i.v）couldnotablyraiseclearanceindexK,phagotrophiccoefficientαandspleencoefficientinnormalandbearingH22cancermice,respectively.ThehighandmiddlegroupsofHFLsignificantlyboostedthedelayedhypersensitivityreactioninducedby2,4-dinitro-1-fluorobenzene(DNFB)inbearingcancerandnormalmice.HFLshowednosignificantinfluenceontheserumHC50ofbearingcancerandnormalmice.EffectsofHFLonbiologicalregulatoryfactorsinbearingH22cancermouseThehighdosegroupofHFL(1.0g/kg,i.v)increasedtheIFN-γlevelintheserumofH22bearingcancermouse(P).AlldatainexperimentsofstrengtheningthebodyresistanceshowedthatHFLcouldenhancethehostimmunefunctionsignificantly.Effectonreducingthetoxicity(Reducethetoxicityofradiotherapyandchemotherapy)ThehighdosegroupofHFL(1.0g/kg,i.v)couldcounteractthedecreaseofperipheralwhitebloodcells(PWBC),marrownucleatedcellsandspleenindexofbearingcancerandnormalmiceinducedbyCytoxan(CTX)or60Co.ResultshereshowedthatHFLcouldcounteractthetoxicityofradiotherapyandchemotherapyinsomeway.ResearchesonthemechanismsInMTTreductionassayexperiments,HFLshoweddifferentgrowthinhibitioneffectsondifferenthumancancercells.ByusingthemethodsofflowcytometryandDNALadder,theformationofDNAfragmentafterusingHFLwasdetected.It’satypicalappearanceofapoptosis.TheformationsofDNAfragmentshavebeendetectedincancercells,whichareinhibitedbyHFLsignificantly.Onthecontrary,nofragmentscouldbefound.TheseresultsshowedthatHFLcouldkillthecancercellbyinducingapoptosisandinhibitcellproliferation.HFLcouldinhibitcancercellsproliferationdirectlyandinducecancercellsapoptosis.Thesemightbeoneoftheantineoplasticmechanisms.5.Otherexperiments(SeriesstudiesoforalGanodermaLucidumSporeOil,etc,detailsnotbeenshowedhere.)KeyWords:GanodermaLucidiumSporeOil,InjectionEmulsion,Antineoplastic,ImmuneFunction,EliminatePathogenicFactors，ReinforcetheHealthyQi，ReduceToxicity,Apoptosis.十一、致谢本项目是在合作导师雷林生教授（南方医科大学）、刘菊妍（广州医药集团总工程师、教授级高工）、葛发欢（广州汉方现代中药研究开发副总经理教授级高工）的共同悉心指导下完成的。他们高尚的人格、渊博的学识、严谨的治学态度使我获益匪浅，衷心感谢他们对我的谆谆教诲和无微不至的关怀。感谢广州医药集团人事科陈颂明科长、技质部吴义忠科长等领导，南方医科大学博士后管理处钟军、许兆峰等老师在工作和生活上的诸多指导、关心和帮助。工作中得到广州汉方现代中药研究开发各位同事的热情帮助和极大支持，在此深表谢忱。最后，我还要向我的妻子王缨、女儿蒋天美表示衷心的感谢，是她们在生活和工作中给予了我无私的奉献和支持。

论大学生写作能力写作能力是对自己所积累的信息进行选择、提取、加工、改造并将之形成为书面文字的能力。积累是写作的基础，积累越厚实，写作就越有基础，文章就能根深叶茂开奇葩。没有积累，胸无点墨，怎么也不会写出作文来的。写作能力是每个大学生必须具备的能力。从目前高校整体情况上看，大学生的写作能力较为欠缺。一、大学生应用文写作能力的定义那么，大学生的写作能力究竟是指什么呢？叶圣陶先生曾经说过，“大学毕业生不一定能写小说诗歌，但是一定要写工作和生活中实用的文章，而且非写得既通顺又扎实不可。”对于大学生的写作能力应包含什么，可能有多种理解，但从叶圣陶先生的谈话中，我认为：大学生写作能力应包括应用写作能力和文学写作能力，而前者是必须的，后者是“不一定”要具备，能具备则更好。众所周知，对于大学生来说，是要写毕业论文的，我认为写作论文的能力可以包含在应用写作能力之中。大学生写作能力的体现，也往往是在撰写毕业论文中集中体现出来的。本科毕业论文无论是对于学生个人还是对于院系和学校来说，都是十分重要的。如何提高本科毕业论文的质量和水平，就成为教育行政部门和高校都很重视的一个重要课题。如何提高大学生的写作能力的问题必须得到社会的广泛关注，并且提出对策去实施解决。二、造成大学生应用文写作困境的原因：（一）大学写作课开设结构不合理。就目前中国多数高校的学科设置来看，除了中文专业会系统开设写作的系列课程外，其他专业的学生都只开设了普及性的《大学语文》课。学生写作能力的提高是一项艰巨复杂的任务，而我们的课程设置仅把这一任务交给了大学语文教师，可大学语文教师既要在有限课时时间内普及相关经典名著知识，又要适度提高学生的鉴赏能力，且要教会学生写作规律并提高写作能力，任务之重实难完成。（二）对实用写作的普遍性不重视。“大学语文”教育已经被严重地“边缘化”。目前对中国语文的态度淡漠，而是呈现出全民学英语的大好势头。中小学如此，大学更是如此。对我们的母语中国语文，在大学反而被漠视，没有相关的课程的设置，没有系统的学习实践训练。这其实是国人的一种偏见。应用写作有它自身的规律和方法。一个人学问很大，会写小说、诗歌、戏剧等，但如果不晓得应用文写作的特点和方法，他就写不好应用文。（三）部分大学生学习态度不端正。很多非中文专业的大学生对写作的学习和训练都只是集中在《大学语文》这一门课上，大部分学生只愿意被动地接受大学语文老师所讲授的文学经典故事，而对于需要学生动手动脑去写的作文，却是尽可能应付差事，这样势必不能让大学生的写作水平有所提高。（四）教师的实践性教学不强。学生写作能力的提高是一项艰巨复杂的任务，但在教学中有不少教师过多注重理论知识，实践性教学环节却往往被忽视。理论讲了一大堆，但是实践却几乎没有，训练也少得可怜。阅读与写作都需要很强的实践操作，学习理论固然必不可少，但是阅读方法和写作技巧的掌握才是最重要的。由于以上的原因，我们的大学生的写作水平着实令人堪忧，那么如何走出这一困境，笔者提出一些建议，希望能对大学生写作水平的提高有所帮助。三、提高大学生应用写作能力的对策（一）把《应用写作》课设置为大学生的必修课。在中国的每一所大学，《应用写作》应该成为大学生的必修课。因为在这个被某些人形容为实用主义、功利主义甚嚣尘上的时代，也是个人生存竞争最激