药物分析课件第9章-维生素类药物分析

基本要求一、掌握维生素类药物的结构特点与分析方法之间的关系。二、掌握维生素类药物的鉴别原理与方法。三、掌握三点校正法测定维生素A的原理、测定方法与计算方法。四、掌握维生素D的HPLC含量测定法和维生素E的GC含量测定法。五、掌握维生素B1非水溶液滴定法与维生素C碘量法的测定原理、方法与注意事项。六、熟悉本类药物其他的含量测定方法。七、熟悉本类药物杂质检查方法。八、了解维生素A三点校正法的推导过程。返回第一页，共127页。概述维生素：是维持人体正常代谢机能所必需的微量营养物资。人体不能合成维生素。第二页，共127页。

VitA、D2、D3、E、K1

等脂溶性水溶性

VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、叶酸、烟酸、泛酸等。分类按溶解度分返回第三页，共127页。-H维生素A醇-COCH3维生素A醋酸酯-COC15H31维生素A棕榈酸酯R:第一节维生素A第四页，共127页。为一个具有共轭多烯侧链的环己烯（一）结构与性质一、具有UV吸收存在多种立体异构化合物第五页，共127页。VitA2VitA3易发生脱氢、脱水、聚合反应第六页，共127页。鲸醇第七页，共127页。△或有金属离子存在时氧化↑共轭多烯侧链易被氧化（二）第八页，共127页。环氧化物VitA醛VitA酸第九页，共127页。三氯化锑反应（一）条件无水无醇CHCl3鉴别试验二、第十页，共127页。蓝色紫红第十一页，共127页。（BP（2000））λmax为326nm一个吸收峰UV法（二）λmax为350～390nm三个吸收峰第十二页，共127页。去水VitA（VitA3）↓VitA第十三页，共127页。第十四页，共127页。USP显色剂磷钼酸规定斑点颜色和Rf值BP

杂质对照品法显色剂三氯化锑TLC法（三）第十五页，共127页。立体异构体氧化降解产物合成中间体UV法（一）含量测定三、维生素A2维生素A3环氧化物维生素A醛维生素A酸第十六页，共127页。三点校正法（法定方法）1.原理：（1）杂质的吸收在310~340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；（2）物质对光的吸收具有加和性。第十七页，共127页。2.波长的选择：（1）1

VitA的max（328nm）（2）23

分别在1的两侧各选一点第十八页，共127页。测定对象VitA醋酸酯第一法等波长差法=12nm第十九页，共127页。第二法等吸收比法测定对象VitA醇1=325nm,2=310nm,3=334nm第二十页，共127页。测定法（1）基本步骤:第一步A的选择选择依据：所选A值中杂质的干扰已基本消除第二十一页，共127页。注意：

C为混合样品的浓度第二步求第二十二页，共127页。第三步求效价换算因数由纯品计算而得：第二十三页，共127页。第二十四页，共127页。第二十五页，共127页。第四步：求标示量％第二十六页，共127页。方法：（2）

第一法维生素A醋酸酯第二十七页，共127页。判断是否在326～329nm之间在326～329nm之间改用第二法是否求算并与规定值比较第二十八页，共127页。

规定值差值第二十九页，共127页。

判断差值是否超过规定值的有一个以上超过无超过

计算A328（校正）

用A328计算第三十页，共127页。第三十一页，共127页。03%－15%－3%第二法第二法第三十二页，共127页。讨论VA醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式法（即代数法）推导而来；VA醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（几何法或称6/7定位法）推导而来。在应用三点校正法时，除其中一点在最大吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。在测定前务必要校正波长。测定的样品应不得少于两份。第三十三页，共127页。

VitAD胶丸中VitA的含量测定

精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物0.1287g至10ml烧杯中，加环己烷溶解并定量转移至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为第三十四页，共127页。A300：0.374A316

：0.592A328：0.663A340：0.553A360：0.228A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.344求本品中维生素A占标示量的百分含量？第三十五页，共127页。A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299

+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)=3.52(2×0.663–0.592–0.553)=0.637第三十六页，共127页。A328(校正)–A328(实测)A328(实测)×100=0.637–0.6630.663×100=-3.92E1%1cm(328nm)=A328(校正)100ms/D=0.637100×0.1287/1250=61.87第三十七页，共127页。供试品中维生素A效价=E1%1cm(328nm)×1900=61.87×1900=117553（IU/g）标示量%=VA效价(IU/g)×每丸内容物平均装量(g/丸)标示量(IU/丸)×100%=117553×0.0798510000×100%=93.9%第三十八页，共127页。适用于维生素A醇（等吸收比法）第一法无法消除杂质干扰时用此法[皂化法、6/7A法]（3）第二法第三十九页，共127页。水溶性脂溶性第四十页，共127页。判断max是否在323～327nm之间取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定计算是否第四十一页，共127页。判断A300/A325是否大于0.73是否取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定计算A325(校正)第四十二页，共127页。第四十三页，共127页。03%－3%第四十四页，共127页。三氯化锑比色法（二）优点简便快速λmax618nm～620nm标准曲线法缺点呈色不稳定（5~10s内）水分干扰与标准曲线温差≤1℃专属性差三氯化锑有腐蚀性（二）蓝色+3SbClVitA返回第四十五页，共127页。第二节维生素D维生素D2一、结构与性质第四十六页，共127页。维生素D3第四十七页，共127页。开环的甾体：具有甾类化合物的显色反应，可用于鉴别。手性碳原子：具有旋光性，可用于鉴别。

多烯：可进行紫外检测。

第四十八页，共127页。二、鉴别试验1.显色反应醋酐--硫酸反应D2

黄红紫绿

D3

黄红紫、蓝绿绿三氯化锑反应橙红色渐变粉红三氯化铁反应橙黄色二氯丙醇和乙酰氯反应绿色第四十九页，共127页。2.比旋度鉴别维生素D2维生素D3溶剂

浓度比旋度值无水乙醇无水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5°～+107.5°+105°～+112°注意事项：应于容器开启30分钟内取样，在溶液配制后30分钟内测定。第五十页，共127页。

3.区别反应：以96%乙醇为溶剂，加乙醇和85%硫酸，D2显红色，在570nm处有最大吸收，D3显黄色，在495nm处有最大吸收。

4.其他方法：

TLC、HPLC、制备衍生物测熔点

第五十一页，共127页。三、杂质检查维生素D2中麦角甾醇的检查：加洋地黄皂苷溶液，混合，放置18h不得发生浑浊或沉淀。前维生素D的光照产物第五十二页，共127页。四、含量测定方法中国药典（2000年版）采用正相高效液相色谱法测定维生素D的含量，定量方法为内标法，内标物为邻苯二甲酸二甲酯，该法分为三个方法。

固定相：硅胶

流动相：正己烷-正戊醇（997：3）第五十三页，共127页。第一法：用于无维生素A醇及其它杂质的干扰的情况，步骤如下：

1．系统适用性试验：测定重复性和分离度。

第五十四页，共127页。

2．测定校正因子：

AS/mS

f1=--------

Ar/mr

f2=（ASmr-f1mSAr1）/（Ar1mS）

3．含量测定：

mi=（f1Ai1+f2Ai2）mS/AS第五十五页，共127页。第二法：用于有杂质的干扰的情况，步骤如下：

1．皂化处理：皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸除乙醚、制备供试液A。

2．净化：供试液A经液相色谱分离，准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，制备成供试液B。

固定相：ODS

流动相：甲醇-乙腈-水（50：50：2）

3．含量测定：取供试液B按第一法测定。

第五十六页，共127页。第三法：用于经第二法处理后仍有杂质的干扰的情况。步骤如下：1．制备供试液：取供试液A，净化，水浴加热，得供试液C。

制备对照液：对照品储备液：稀释、加热。

2．含量测定：在第一法的色谱条件下，交替精密进样对照液和供试液，按外标法定量。返回第五十七页，共127页。苯并－二氢吡喃醇第三节维生素E

第五十八页，共127页。名称R1R2相对活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1***第五十九页，共127页。dl－α－生育酚醋酸酯第六十页，共127页。结构与性质一、苯环+二氢吡喃环+饱和烃链1、UV2、乙酰化的酚羟基易水解]O[醌型化合物△生育酚-+orOHHVitE杂质，需检查第六十一页，共127页。]O[生育红（一）硝酸反应橙红色鉴别二、75℃15′HNO3VitE生育酚第六十二页，共127页。（橙红色）生育红生育酚HNO3强氧化剂第六十三页，共127页。三氯化铁－联吡啶反应（二）第六十四页，共127页。生育酚对-生育醌[O]弱氧化剂第六十五页，共127页。血红色第六十六页，共127页。

=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%无水乙醇中UV法（三）第六十七页，共127页。薄层板硅胶G展开剂环己烷-乙醚（4：1）显色剂硫酸（105℃5′）VitERf

=0.7-生育酚Rf

=0.5-生育醌Rf

=0.9TLC法（四）第六十八页，共127页。2.游离生育酚

杂质检查

三、原理酸度

以NaOH滴定液（0.1mol/L）体积控制。第六十九页，共127页。（M生育酚=430.8）例

取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过1.0ml。第七十页，共127页。≤2.15％限量第七十一页，共127页。四、含量测定GC法（法定方法）（一）GC特点1、选择性好灵敏度高速度快分离效能好挥发性低、不稳定、极性强→衍生化易受样品蒸气压限制第七十二页，共127页。载气→N2固定液→硅酮（OV-17）担体→硅藻土或高分子多孔小球柱温→265℃检测器→氢火焰离子化检测器(FID)内标→正三十二烷

n≥500R≥2VitE测定的色谱条件2、内标法加校正因子第七十三页，共127页。内标法供试液（样品+内标）内标物对照液（对照+内标）是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近能与各组分完全分离与被测组分的量接近第七十四页，共127页。校正因子：第七十五页，共127页。WWKK%VitE%10012=稀释倍数稀释倍数样对实际工作中的计算方法××××第七十六页，共127页。（二）HPLC法外标法此外，还有铈量法、比色法和荧光法返回第七十七页，共127页。氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵碱)第四节维生素B1HClCl-第七十八页，共127页。（一）溶解性1、易溶于水2、水溶液呈酸性（二）UV共轭双键λmax=246nm结构与性质一、第七十九页，共127页。与生物碱↓→↓（三）硫色素反应（四）嘧啶环——噻唑环——（五）盐酸根呈氯化物的反应，用于鉴别。第八十页，共127页。ChP鉴别试验二、（一）硫色素反应第八十一页，共127页。第八十二页，共127页。硫色素＋2H第八十三页，共127页。VitB1H+H+H+H+（二）沉淀反应第八十四页，共127页。S元素反应Cl-反应（三）其他反应()21PbSNaSVitBNO3PbNaOH第八十五页，共127页。三、含量测定喹那啶红－亚甲蓝（紫红→天蓝）（一）非水溶液滴定法第八十六页，共127页。反应摩尔比为1：2第八十七页，共127页。UV法（二）第八十八页，共127页。片剂、注射剂=421（每片）相当于标示量的%=A=ECL规格g/片g/100mlgChPWEA%cmD10011××%100标示量平均片重××第八十九页，共127页。（每ml）相当于标示量的%=规格g/mlml%VEA%cm100110011×标示量稀释倍数××第九十页，共127页。（三）硫色素荧光法原理1、荧光硫色素异丁醇铁氰化钾1VitBNaOH第九十一页，共127页。特点2、（1）灵敏度高，线性范围宽（2）代谢产物不干扰，适用于体液分析第九十二页，共127页。第五节维生素CL－抗坏血酸第九十三页，共127页。1、易溶于水2、水溶液呈酸性结构与性质一、（一）溶解性第九十四页，共127页。二烯醇结构二酮基结构二烯醇结构（二）还原性第九十五页，共127页。有活性有活性无活性第九十六页，共127页。△糖类的显色反应50℃结构与糖类相似（三）具糖的性质第九十七页，共127页。C3－OH的pKa=4.17C2－OH的pKa=11.57酸性（四）一元酸第九十八页，共127页。L(+)－抗坏血酸活性最强手性C（C4、C5）（五）光学活性**第九十九页，共127页。与碱反应（六）水解性第一百页，共127页。第一百零一页，共127页。与氧化剂的反应（一）鉴别试验二、去氢抗坏血酸]O[VitC第一百零二页，共127页。1、与AgNO3反应2、与2，6-二氯靛酚反应(ChP2000)氧化型玫瑰红色还原型蓝色(ChP2000)第一百零三页，共127页。（玫瑰色）（无色）第一百零四页，共127页。3.其他氧化剂的反应：亚甲蓝或高锰酸钾试剂褪色

碱性酒石酸铜砖红色沉淀

磷钼酸钼蓝

第一百零五页，共127页。糖类的反应（二）或盐酸50℃吡咯USP第一百零六页，共127页。第一百零七页，共127页。（蓝色）(糠醛)（戊糖）50℃(吡咯)第一百零八页，共127页。UV（三）BP0.01mol/LHCl第一百零九页，共127页。三、杂质检查

1.溶液的澄清度与颜色：有色杂质分光光度法

2.铁、铜离子：原子吸收分光光度法第一百一十页，共127页。指示剂淀粉指示液原理1、碘量法（一）含量测定四、第一百一十一页，共127页。H+第一百一十二页，共127页。取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6。方法2、第一百一十三页，共127页。（1）酸性环境d.HCl（2）新沸冷H2O减慢VitC被O2氧化速度讨论3、（3）立即滴定赶走水中O2减少O2的干扰第一百一十四页，共127页。（4）附加剂干扰的排除片剂——滑石粉——过滤注射剂——抗氧剂——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5第一百一十五页，共127页。CHHOOaS3aSO+H2NHON2252HONHCOS3a第一百一十六页，共127页。2，6-二氯靛酚钠滴定法法（二）USPJP原理1、酚亚胺二氯靛酚，-62VitC第一百一十七页，共127页。自身指示终点法方法2、第一百一十八页，共127页。（2）快速滴定2min内（1）酸性环境HPO3-HAc稳定VitC防止其他还原性物质干扰（3）剩余比色测定（定量过量）（测剩余染料）讨论3、第一百一十九页，共127页。（4）缺点

需经常标定贮存≤一周不稳定干扰多氧化力较强第一百二十页，共127页。

公元前3500年-古埃及人发现能防治夜盲症的物质，也就是后来的维A。

1600年-医生鼓励以多吃动物肝脏来治夜盲症。

1747年-苏格兰医生林德发现柠檬能治坏血病，也就是后来的维C。

1831年-胡萝卜素被发现。

1905年-甲状腺肿大被碘治愈。

1911年-波兰化学家丰克为维生素命名。

1915年-科学家认为糙皮病是由于缺乏某种维生素而造成的