基因工程及其应用课时

基因工程及其应用课时第1页，共68页，2023年，2月20日，星期四能发光的水母请您欣赏能否让热带鱼也能发光?设想不能发光的热带斑马鱼第2页，共68页，2023年，2月20日，星期四能发荧光的热带斑马鱼普通热带斑马鱼是不发荧光的第3页，共68页，2023年，2月20日，星期四请您欣赏超级小鼠与超级鱼第4页，共68页，2023年，2月20日，星期四能产生人胰岛素的大肠杆菌请您欣赏第5页，共68页，2023年，2月20日，星期四基因“嫁接”第6页，共68页，2023年，2月20日，星期四一、基因工程（一）概念：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。原理操作环境操作水平结果基因重组生物体外DNA分子水平定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。剪切→拼接→导入→表达基本过程第7页，共68页，2023年，2月20日，星期四培育转基因大肠杆菌的简要过程：你认为上述培育转基因大肠杆菌的关键步骤有哪些？普通大肠杆菌(不能分泌胰岛素)人体组织细胞提取胰岛素基因与运载体DNA拼接导入大肠杆菌(含胰岛素基因)转基因大肠杆菌(能分泌胰岛素)实例展示第8页，共68页，2023年，2月20日，星期四1.ONE胰岛素基因从人体细胞内提取出来2.TWO胰岛素基因与运载体DNA连接3.THREE胰岛素基因导入受体(大肠杆菌)细胞基因的“剪刀”基因的“针线”基因的运载体培育转基因大肠杆菌的关键步骤：第9页，共68页，2023年，2月20日，星期四（二）基因工程操作工具1、基因剪刀----限制酶（1）功能：识别特定核苷酸序列，切割特定DNA切点，具特异性，并裂解磷酸二酯键。限制酶特异性识别的切割部位都具有回文序列。即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。EcoRⅠGAATTCCTTAAG5′3′5′3′5′GCTTAAAATTCG3′3′5′粘性末端第10页，共68页，2023年，2月20日，星期四SmaⅠCCCGGGGGGCCC5′3′3′5′5′CCCGGGGGGCCC3′3′5′平口末端（2）结果：产生两个带有相同黏性末端或平口末端的DNA片段（3）要想从DNA上切下某个基因,应切2个切口,产生4个黏性末端（4）限制酶不是一种酶，而是一类酶，目前已发现的限制酶有4000多种。第11页，共68页，2023年，2月20日，星期四限制性内切酶（EcoRⅠ）作用过程点击播放第12页，共68页，2023年，2月20日，星期四黏性末端例：大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)能识别

GAATTC序列，并在G和A之间切开。EcoRⅠ第13页，共68页，2023年，2月20日，星期四

被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？思考:第14页，共68页，2023年，2月20日，星期四2、基因的“针线”——DNA连接酶连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。连接的部位：相邻的两个脱氧核苷酸的切口，

即：

生成磷酸二酯键DNA连接酶的作用过程：第15页，共68页，2023年，2月20日，星期四基因的针线：DNA连接酶

G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GGC

TT

AA

AA

TT

C

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同种限制酶切割第16页，共68页，2023年，2月20日，星期四3、基因的运输工具——运载体本质：小型环状DNA分子常用的运载体：质粒、噬菌体动植物病毒等其共同特点是：都有侵染或进入宿主细胞的能力标记基因，便于进行检测。

质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中,是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子.

第17页，共68页，2023年，2月20日，星期四作为运载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。1、细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子；2、质粒的存在对宿主细胞无影响；3、质粒的复制只能在宿主细胞内完成。质粒有何特点？第18页，共68页，2023年，2月20日，星期四易错警示（3)操作工具有三种，但工具酶只有两种，另一种工具运载体的化学本质为DNA。第19页，共68页，2023年，2月20日，星期四（4）与DNA有关酶的作用DNA酶：即DNA水解酶，可以将DNA水解成脱氧核苷酸。DNA聚合酶：在DNA复制的过程中，连接单个游离的脱氧核苷酸到DNA片段上，需要模板。DNA连接酶：连接两个DNA片段，形成磷酸二酯键，不需要模板。解旋酶：在DNA复制时，破坏氢键，使DNA双链打开。限制性核酸内切酶：破坏脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。第20页，共68页，2023年，2月20日，星期四例1、已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点,如下图中箭头所指｡如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断,则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段｡现有多个上述线性DNA分子,若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断,则从理论上讲,经该酶酶切后,这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是()

A.3 B.4

C.9 D.12答案:C第21页，共68页，2023年，2月20日，星期四例2、下列有关基因工程中限制性内切酶的描述，

错误的是()

A.一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列

B.限制性内切酶的活性受温度影响

C.限制性内切酶能识别和切割RNA

D.限制性内切酶可从原核生物中提取答案:C第22页，共68页，2023年，2月20日，星期四

3、质粒是基因工程最常用的运载体,有关质粒的说法正确的是()

A.质粒不仅存在于细菌中,某些病毒也具有

B.细菌的基因只存在于质粒上

C.质粒为小型环状DNA分子,存在于拟核(或细胞核)外的细胞质基质中

D.质粒是基因工程中的重要工具酶之一答案:C第23页，共68页，2023年，2月20日，星期四4、下列关于DNA连接酶的作用叙述,正确的是()

A.将单个核苷酸加到某DNA片段末端,形成磷酸二酯键

B.将断开的两个DNA片段的骨架连接起来,重新形成磷酸二酯键

C.连接两条DNA链上碱基之间的氢键

D.只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来,而不能将双链DNA片段末端之间进行连接答案:B第24页，共68页，2023年，2月20日，星期四二、基因工程的操作步骤第25页，共68页，2023年，2月20日，星期四从细胞中分离出DNA从大肠杆菌中提取质粒限制酶提取目的基因限制酶目的基因与运载体结合DNA连接酶目的基因导入受体细胞目的基因的表达与检测三、基因工程的操作步骤第26页，共68页，2023年，2月20日，星期四四个基本步骤：1）提取目的基因2）目的基因与运载体结合3）将目的基因导入受体细胞4）目的基因的检测和表达三、基因工程的操作步骤第27页，共68页，2023年，2月20日，星期四1.目的基因的提取方法直接分离基因人工合成基因反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA：鸟枪法第28页，共68页，2023年，2月20日，星期四用限制酶切断成许多片段⑴直接分离基因——鸟枪法具体做法：将供体细胞中的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到不同的受体细胞中去，让这些DNA片段在受体细胞中扩增。从中找出含有目的基因细胞，并将含有目的基因的DNA片段分离出来。该法最大的缺点：带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。所以一般不适用于真核细胞的基因。第29页，共68页，2023年，2月20日，星期四⑵人工合成基因法DNA合成仪②直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。①反转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。第30页，共68页，2023年，2月20日，星期四1）反转录法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）直接合成法：根据已知的氨基酸序列合成DNA（2）人工合成目的基因第31页，共68页，2023年，2月20日，星期四利用PCR技术扩增目的基因聚合酶链式反应过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、复性（55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链原理：DNA复制第32页，共68页，2023年，2月20日，星期四质粒一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种限制酶目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。DNA分子2、目的基因与运载体结合注意：要用同一种限制酶切取目的基因和运载体，并用DNA连接酶连接。作用：将外源基因送入受体细胞第33页，共68页，2023年，2月20日，星期四

用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连拉酶的作用下连接形成重组DNA分子。2.目的基因与运载体结合

目的基因与运载体结合的结果可能有三种情况：目的基因与目的基因结合，质粒与质粒结合，目的基因与质粒结合。所以需要筛选。作用：将外源基因送入受体细胞第34页，共68页，2023年，2月20日，星期四常用的受体细胞：3.目的基因导入受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。主要借鉴细菌或病毒侵然细胞的途径导入方式：导入扩增第35页，共68页，2023年，2月20日，星期四1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。

2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。

3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。导入过程：运载体为质粒，受体细胞为细菌第36页，共68页，2023年，2月20日，星期四大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物

4.目的基因的检测和表达检测：通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入。表达：通过特定性状或蛋白质的产生与否来确定目的基因是否表达。如棉花抗虫性状的表现标记基因一般都是抗生素抗性基因，只要在相应的抗生素培养基上培养筛选就可以，能活下来的就是目的基因已经进入受体细胞第37页，共68页，2023年，2月20日，星期四受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？方法：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。第38页，共68页，2023年，2月20日，星期四技法提炼基因工程操作的归纳总结

第39页，共68页，2023年，2月20日，星期四基因工程操作的归纳总结第40页，共68页，2023年，2月20日，星期四C第41页，共68页，2023年，2月20日，星期四集训真题·体验高考A解析答案第42页，共68页，2023年，2月20日，星期四A第43页，共68页，2023年，2月20日，星期四4.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是()A.常用相同的限制性核酸内切酶处理目的基因和质粒B.DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶C.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒D.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达B第44页，共68页，2023年，2月20日，星期四5.利用外源基因在受体细胞中表达,可生产人类所需要的产品｡下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是()

A.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因

B.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA

C.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列

D.酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白

答案:D第45页，共68页，2023年，2月20日，星期四补充：基因诊断与基因治疗

诊断：用放射性同位素等标记的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。我国研究人员正在制备用于基因治疗的基因工程细胞

治疗：把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。第46页，共68页，2023年，2月20日，星期四基因诊断——DNA探针概念：是用已知序列的DNA或RNA片段作为探针与待测样品的DNA或RNA序列进行核酸分子杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测，是基因诊断最基本的技术之一。条件:（1）必须是单链；（2）带有容易被检测出来的标记物

原理：DNA分子杂交（碱基互补配对）第47页，共68页，2023年，2月20日，星期四基因诊断——生物芯片

从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱；从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。第48页，共68页，2023年，2月20日，星期四基因治疗——用正常的基因取代或修补病人细胞中有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的第49页，共68页，2023年，2月20日，星期四

1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将这个女孩的白血球进行基因改造，使有缺陷的基因被健康的基因替代，然后把含正常白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。后来，她的免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活，并进入普通小学上学。第50页，共68页，2023年，2月20日，星期四

转基因抗虫棉花转入苏云金杆菌的一个抗虫基因，是中国目前最主要的转基因作物

四、基因工程的应用1、基因工程与作物育种第51页，共68页，2023年，2月20日，星期四转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯不会引起过敏的转基因大豆第52页，共68页，2023年，2月20日，星期四运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼(中国)第53页，共68页，2023年，2月20日，星期四导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠导入人基因具特殊用途的猪和小鼠超级动物特殊动物第54页，共68页，2023年，2月20日，星期四我国生产的部分基因

工程疫苗和药物⑴基因工程药品的生产许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。

微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。2、基因工程在医学上的应用第55页，共68页，2023年，2月20日，星期四胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%!第56页，共68页，2023年，2月20日，星期四通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1Kg的培养液可提取20—4０mg干扰素。干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。第57页，共68页，2023年，2月20日，星期四基因工程人干扰素α-2b（安达芬），是我国第一个全国产业化基因工程。安达芬具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。第58页，共68页，2023年，2月20日，星期四其它基因工程药物人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。人造血液及其生产第59页，共68页，2023年，2月20日，星期四取患者骨髓分离干细胞病毒正常基因导入正常基因的干细胞注入患者体内第60页，共68页，2023年，2月20日，星期四⑴环境监测：

基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来3、基因工程与环境保护第61页，共68页，2023年，2月20日，星期四

利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。第62页，共68页，2023