(4.7)-第二章酶的生产酶工程教学

提取分离法生物合成法化学合成法

酶的生产微生物细胞发酵产酶植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞（动物、植物、微生物）的生命活动，大规模发酵生产所需的酶的技术过程。大多数酶的生产采用微生物发酵生产，原因？微生物研究充分、种类多、繁殖快、易培养、代谢能力强。第二章酶的发酵工程微生物发酵产酶酶的微生物合成的调节产酶微生物酶发酵生产的工艺控制酶发酵动力学

第一节酶的微生物合成的调节一、酶生物合成的基本过程二、酶生物合成的调节机制三、酶生物合成的模式遗传信息传递的中心法则蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA加工、组装P酶R酶一、酶生物合成的基本过程（一）RNA的生物合成——转录(transcription)

以DNA为模板，以三磷酸核苷为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACGCAURNA聚合酶RNAPPi5’5’3’GTPUTPCTPATPUTP3’3’5’编码链（codingstrand)模板链（templatestrand）RNA合成过程起始阶段双链DNA局部解开磷酸二酯键形成终止阶段解链区到达基因终点延伸阶段53RNA

启动子（promotor)

终止子(terminator)5RNA聚合酶5353553离开RNA合成过程——前体加工以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。蛋白质的合成过程：氨基酸的活化、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止、肽链加工（二）蛋白质的生物合成——翻译(translation)

1.氨基酸的活化与转运AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶AA-tRNA+AMP+PPi肽链合成时的第一个氨基酸：真核生物：甲硫氨酸（Met）原核生物：甲酰甲硫氨酸（fMet）AA+ATP+EE-AA-AMP+PPiE-AA-AMP+tRNAAA-tRNA+AMP+E

2.多肽合成

起始阶段A位点（aminoacylsite）P位点（peptidylsite）E位点（exitsite）延伸阶段肽基转移酶终止阶段3.肽链的加工N端Met、fMet的切除二硫键的形成肽链的剪切肽链的折叠氨基酸侧链修饰转录水平的调节转录产物的加工调节翻译水平的调节翻译产物的加工调节酶降解调节酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节机制（一）酶合成调节的类型

诱导（induction）和阻遏（repression）1.诱导（induction）：酶促分解底物或产物诱使微生物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。组成酶（constitutiveenzyme）：DNA酶，RNA酶，糖酵解途径酶等诱导酶（adaptive/regulatedenzyme）：

β-半乳糖苷酶等酶的类型合成是否受环境因素影响？诱导酶：微生物通过诱导作用而产生的酶（为适应外来底物或其结构类似物或产物而临时合成的酶类）。诱导物（inducer）：底物或结构类似物、产物诱导作用的类型：协同诱导：诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导出几种酶的合成，主要存在于短的代谢途径中。顺序诱导：先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。诱导的意义：体现菌体生物合成的经济原则——需要时才合成2.阻遏（repression）：阻碍代谢过程中包括关键酶在内的一系列酶的合成的现象，从而更彻底地控制和减少末端产物的合成。阻遏作用的类型：终产物阻遏（end-productrepression）/反馈阻遏（feedbackrepression）分解代谢产物阻遏（cataboliterepression）阻遏的意义：体现菌体生长的经济原则——不需要就不合成。①终产物阻遏（反馈阻遏）合成代谢途径的终产物过量积累时对参与该途径反应所需的一个或多个酶的合成的阻遏。①直线式反应途径（协同阻遏）：末端产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合成受阻遏。②分支代谢途径：每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。②分解代谢物阻遏细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。葡萄糖效应1.操纵子学说：Jacob、Monod因1960年提出mRNA及操纵子的理论，获得1965年诺贝尔生理学或医学奖。

启动基因操纵基因结构基因操纵子1.RNA聚合酶结合位点2.cAMP及其受体蛋白复合物（CRP-cAMP）结合位点（二）酶合成调节的机制——操纵子学说调节基因与变构蛋白结合编码一个或多个酶的基因编码调节蛋白调节蛋白：两个特殊位点：其一可与操纵基因结合，另一位点则可与效应物相结合。效应物：诱导物、辅阻遏物作用原理：当调节蛋白与效应物结合后，就发生变构作用(变构蛋白)，其变构后可提高或降低其与操纵基因的结合能力。基因操纵子调节系统示意图

调节基因

启动基因操纵基因结构基因

DNA

转录

（-）

RNA聚合酶（+）转录

翻译

mRNA

变构蛋白

翻译

调节蛋白

蛋白质

效应物

控制区信息区操纵子诱导型操纵子阻遏型操纵子2.操纵子的分类——诱导型、阻遏型①诱导型操纵子（inducibleoperon）：只有当存在诱导物时，其转录频率才最高，并随之转译出大量诱导酶，出现诱导现象。例：乳糖操纵子（Lacoperon）

分解利用乳糖的酶：

-半乳糖苷酶（lacZ）；-半乳糖苷透过酶（lacY）；

-半乳糖乙酰化酶（lacA）

实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成

表明乳糖的存在诱导了相关酶的合成。调节基因操纵基因乳糖酶结构基因PLacZLacYLacAmRNA

阻遏蛋白（有活性）基因关闭启动基因OIPLacZLacYLacA调节基因操纵基因乳糖酶结构基因启动子OImRNAZmRNAYmRNAA

阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNA别乳糖

阻遏蛋白（有活性）诱导机制Lac操纵子乳糖经β-半乳糖苷酶催化②阻遏型操纵子（repressibleoperon）：只有当缺乏辅阻遏物时，其转录频率才最高。由阻遏型操纵子所编码的酶的合成，只有通过去阻遏作用才能启动。辅阻遏物：阻遏酶产生的物质，可与调节蛋白结合，促进其与操纵基因的结合，抑制转录进行。反馈阻遏例：色氨酸操纵子（Trpoperon）

实验：（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成。（1）阻遏蛋白的负性调控（2）衰减子的调节作用前导序列转录出的前导mRNA含有4个区域：1、2、3、4区，两两之间可形成发夹结构酶的诱导和阻遏操纵子模型B.阻遏蛋白加诱导物A.阻遏蛋白C.阻遏蛋白原D.阻遏蛋白原加辅阻遏物操纵基因启动基因调节基因结构基因

阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白结合操纵基因，结构基因不表达诱导物诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起结合操纵基因,结构基因可以表达酶蛋白mRNA阻遏蛋白原不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达阻遏蛋白原(无活性)酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白原结合形成阻遏蛋白，从而结合操纵基因,结构基因不表达代谢产物例：葡萄糖效应实验：E.coli培养在含乳糖和葡萄糖的培养基上，可优先利用葡萄糖，并于葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，这就产生了在两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”。原因：葡萄糖的存在阻遏了分解乳糖酶系合成分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏机制RLacZLacYLacAmRNAmRNAZmRNAYmRNAA基因表达CRP基因结构基因TCRPOCRP-cAMP结合位点RNA聚合酶TCRP-cAMPP葡萄糖分解代谢产物腺苷酸环化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物与cAMP的关系cAMPCRP：分解代谢物活化剂蛋白，环腺苷酸受体蛋白降低cAMP浓度使CAP呈失活状态如何解除？？小结酶合成的诱导及作用机制酶合成的反馈阻遏及作用机制酶合成的分解代谢物阻遏及作用机制操纵子学说！问题延伸：如何稳定地获得大量调节酶？遗传控制（一劳永逸）1.改良菌种(1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型2.基因工程育种

如何操作？？微生物生长曲线：1.延迟期（调整期）2.对数生长期3.稳定期（平衡期）4.衰退期1234三、酶生物合成的模式酶生物合成的模式

根据酶的合成与细胞生长之间的关系，将酶的生物合成分为4种模式：

生长偶联型——同步合成型延续合成型

部分生长偶联型中期合成型非生长偶联型——滞后合成型（Ⅰ）同步合成型：酶的合成与细胞生长同步进行，进入平衡期后，酶的合成随之停止（Ⅱ）延续合成型：酶的合成与细胞生长同步进行，生长进入平衡期后，酶又延续合成一段时间（Ⅲ

）中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，进入平衡期后，酶的合成随之停止（Ⅳ）滞后合成型：细胞生长一段时间后甚至是进入平衡期后，才开始并大量积累酶go特点：（1）酶的生物合成不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏（2）酶所对应的mRNA不稳定。1.同步合成型（生长偶联型）

酶细胞细胞或酶浓度时间大部分组成酶2.中期合成型（部分生长偶联型）特点：（1）酶的合成受到产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏（2）酶所对应的mRNA不稳定。酶细胞

细胞或酶浓度时间特点：（1）酶的合成不受分解代谢物或产物的阻遏（2）酶所对应的mRNA相当稳定3.延续合成型（部分生长偶联型）黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线特点：（1）在对数生长期不合成酶（可能是受到阻遏物的影响）（2）酶所对应的mRNA相当稳定4.滞后合成型（非生长偶联型）酶细胞细胞或酶浓度时间水解酶（1）mRNA的稳定性（2）培养基中阻遏物存在与否影响酶生物合成的模式的主要因素：（1）mRNA稳定性好的，可在细胞停止生长后继续合成其所对应的酶（2）mRNA稳定性差的，酶的合成随着细胞停止生长而终止（3）受某些物质阻遏的，需在细胞生长一段时间或在平衡期后（解除阻遏），开始合成酶（4）不受某些物质阻遏的，酶的合成随着细胞生长而同步增长规律：

酶生产中最理想的合成模式？延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。

如何改造非理想模式？同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度。滞后合成型：尽量减少甚至解除反馈阻遏和分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。小结酶生物合成的四种模式及特点影响酶生物合成的模式的主要因素最理想的酶生物合成模式及其他模式的改造第二节产酶微生物一、常用产酶微生物二、产酶微生物的来源三、菌种的保藏1.产酶微生物的特点产酶量高繁殖快，易培养稳定性好，不易变异退化，抗污染能力强原料价格低廉，生产成本低

易于分离纯化（胞外酶）菌株安全，不是病原菌，不产生有害物质

基因工程菌株的安全性一、常用产酶微生物细菌放线菌酵母菌霉菌2.常用的产酶微生物（1）细菌（Bacterial）球菌杆菌螺旋菌大肠杆菌（E.coli）——胞内酶基因工程常用宿主菌枯草芽孢杆菌（B.subtilis）——多为胞外酶用于生产：淀粉酶（amylase）蛋白酶（proteinase）（2）放线菌(Actinomycetes)呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖和陆生性较强的原核生物。链霉菌属多种酶：纤维素酶、蛋白酶、几丁质酶最大经济价值在于能产生多种抗生素（antibiotics）

伊维菌素——2015年诺贝尔医学奖（3）

酵母菌（yeast）

常用酵母菌有：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)假丝酵母(Candida)类酵母(Saccharomycodes)等用于酿酒、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶、转化酶、尿激酶等。（4）霉菌（mould）工业上常用的霉菌有：藻状菌纲的根霉、毛霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等产品：酶制剂（enzymepreparation）、抗生素(antibiotic)、有机酸（organicacid）及甾体激素（steroidhormone）等。二、产酶微生物的来源

向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买

从自然界中分离筛选

菌种选育1.产酶微生物的购买来源：空气、水体、土壤、生物体分离思路：

从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。2.产酶微生物的分离和筛选

稀释分离法、平板划线法含菌样品采集

富集培养纯种分离纯培养生产性能测定新种分离与筛选的步骤相近菌种产酶性质相似胞外酶与产生菌的最适条件相近底物含量丰富，菌种富集初筛：以量为主复筛：以质为主提高菌种数量，利于分离纯化提高菌种数量3.产酶菌种选育

自然选育诱变育种代谢控制育种原生质体融合育种基因工程育种基因组改组三、菌种的保藏方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价斜面低温保藏法甘油悬液保藏法石蜡油封藏法砂土管保藏法冷冻干燥保藏法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类各大类各大类产孢子微生物各大类3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上简便简便简便简便简便有效第三节酶发酵生产的工艺控制保藏菌种菌种活化菌种扩大培养发酵液分离纯化酶固定化原生质体培养基固定化细胞工艺条件控制pH温度溶氧碳源氮源无机盐生长因素酶发酵生产的一般工艺流程

试管菌种培养茄瓶菌种培养摇瓶菌种培养孢子（菌体）悬液制备种子罐菌种培养发酵罐发酵发酵液预处理酶的分离纯化精制菌种扩大培养一、菌种的扩大培养与退化1.菌种扩大培养：将保藏菌种接入试管斜面活化，再经摇瓶或茄子瓶及种子罐，逐级扩大培养达到一定数量和质量的纯种培养物的过程。纯种培养物——种子

2.种子制备过程3.种子质量控制（1）影响种子质量的因素：培养基培养条件种龄接种量种龄（inoculumage）定义：种子罐中培养的菌丝转入下一级种子罐或发酵罐的培养时间。菌丝体对数生长期，菌体量未到最大，活力最强接种量（inoculationquantity）定义：移入的种子液体积和接种后发酵罐培养液体积之比接种量大：缩短菌丝生长时间，缩短延迟期，提早进入生产期；菌体生长过快，培养液溶氧下降，产量低接种量小：菌丝生长时间长，生产时间长有何影响？（2）种子质量的控制菌种稳定性检查无菌筛查二、培养基的配制培养基：人工配制的用于菌种扩大培养和发酵的各种营养物质的混合物。水碳源基本成分氮源无机盐生长因子生理功能：水是微生物最基本的组成分（70％—90％），直接参与各种代谢活动水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）

水源质量的主要参数包括pH值、溶解氧、污染程度以及矿物质组成和含量等。1.水2.碳源生理功能：碳是构成细胞物质的主要元素之一，也是所有酶的重要组成元素。碳源可作能源，为生命活动提供能量有机碳源/无机碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物速效碳源/迟效碳源不同微生物对碳源的利用有所不同，在酶发酵生产中应注意碳源对酶生物合成的代谢调节作用（诱导和阻遏）如何解除分解代谢物阻遏作用？？补加cAMP分批、流加速效碳源，或只使用迟效碳源选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制生理功能:构成细胞物质和代谢产物的主要元素之一，也是所有酶的重要组成元素。

有机氮源/无机氮源：蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、豆饼粉、花生饼粉、铵盐、硝酸盐

速效氮源/迟效氮源3.氮源4.无机盐生理功能：参与细胞物质和酶的组成调节细胞渗透压、氧化还原电位、pH酶的激活剂

大量元素/微量元素：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁、铜、钼、锌等元素的化合物。5.生长因子微生物细胞生长所必需的微量有机化合物。分类：维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶、生长激素等来源：实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等，发酵生产中常用麦芽浸膏、玉米浆、酵母抽提物等三、培养条件对产酶的调控

1.温度的调节控制不同的微生物有不同的最适生长温度：例：枯草芽孢杆菌最适生长温度34～37℃黑曲霉最适生长温度为28～32℃生长最适温度（高）发酵产酶的最适温度（低）原因：在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。变温发酵原因？温度控制：加热：发酵产热，一般不需加热冷却：冷却水（冷冻盐水）通过夹层或盘管（蛇管）循环冷却。2.pH的调节控制不同的微生物有不同的最适生长pH例：细菌和放线菌：中性或碱性（pH6.5～8.0）霉菌和酵母：偏酸性（pH4～6）生长最适pH：利于菌体生长产酶最适pH：利于酶合成变pH发酵有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。例：采用米曲霉发酵生产蛋白酶时，当培养基的pH值为碱性时，主要生产碱性蛋白酶；培养基的pH值为中性时，主要生产中性蛋白酶；而在酸性的条件下，则以生产酸性蛋白酶为主。发酵过程中，pH值控制和调节方法？？调节基础培养基的配方：调节碳氮比（C/N）添加缓冲剂补料控制：直接加酸加碱补加碳源或氮源3.溶解氧的调节控制溶解氧（dissolvedoxygen，DO）：溶解在培养基中的氧气生理功能：使能源物质经过有氧降解而生成大量的细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要的能量ATP。DO影响因素：通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质（黏度、气泡、温度等）发酵前期：微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，溶氧明显下降。发酵中后期：溶氧浓度明显地受工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等。发酵后期：菌体衰老，呼吸减弱，菌体自溶，溶氧就会明显地上升。发酵过程的溶氧变化若监测到DO异常变化，有何意义？供氧量>需氧量溶氧浓度供氧量<需氧量溶氧浓度临界氧浓度：不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度。最适氧浓度：维持菌体的最大比摄氧率，得到最大的菌体合成量的浓度。二者间平衡发酵过程中，如何对体系的溶氧速率进行调节？？？溶解氧的调节控制方法：调节通气量调节氧分压调节气液接触时间调节气液接触面积改变培养液的性质通气量↑DO↑氧分压↑DO↑时间↑DO↑面积↑DO↑黏度↓DO↑气泡↓DO↑温度↓DO↑4.泡沫的调节控制选育不易产生泡沫的菌种调节培养基中营养成分，减少或缓加易起泡的原料机械消泡/消泡剂消泡5.湿度的调节控制——固体发酵小结：微生物发酵产酶工艺控制培养基成分pH温度溶解氧泡沫湿度四、发酵方法固体发酵——霉菌液体深层发酵（浸没式培养）——最主要液体深层发酵方式：分批发酵连续发酵补料分批发酵1.分批（间歇）发酵batchfermentation营养物和菌种一次加入发酵罐进行培养，直至反应将发酵液一次放出发酵过程进行到一定阶段时，以一定的速度向发酵罐内连续添加新鲜培养基，同时以相同的速度连续流出培养液2.连续发酵continuousfermentation连续加入连续流出3.补料-分批发酵fed-batchfermentation发酵过程中间歇或连续补加新鲜培养基，待发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后停止补料，待发酵结束将发酵液一次全部放出。间歇、连续补加五、提高酶产量的策略酶合成调节机制保证了生物体内酶合成最经济、最有效地利用体内合成的原料与能量。然而从人类利用的目的出发，要使酶产量提高，就要有针对性地打破这种调节机制。从内外两方面入手：①条件控制；②遗抟控制，包括基因突变和基因重组。采取相应措施后，参与分解代谢的酶产量可能有上千倍的变化，而参加合成代谢的酶类则有百余倍的增长。（一）条件控制（外因）1.添加诱导物诱导酶：在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。诱导物一般可以分为3类：酶的作用底物酶的反应产物酶的底物类似物（最有效）阻遏作用根据机理不同，可分为：

反馈阻遏作用：由酶催化作用的末端产物引起的阻遏作用。

分解代谢物阻遏作用：由分解代谢物引起的阻遏作用。

控制阻遏物（末端产物、分解代谢物）浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。2.降低阻遏物浓度减少或者解除分解代谢物阻遏作用可以通过控制培养基中葡萄糖等速效碳源或氮源的浓度来实现，以下关于该方法描述正确的是：采用较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源的方式添加一定量的环腺苷酸（cAMP）及时分离产物，降低末端产物的浓度ABCD提交多选题1分减少或者解除分解代谢物阻遏作用：控制培养基中葡萄糖等速效碳源或氮源的浓度。采用较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源的方式添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。表面活性剂：与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于酶向胞外分泌。非离子型表面活性剂：吐温（Tween）、曲通（Triton）离子型表面活性剂：对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂，对细胞的毒性较大。3.添加表面活性剂产酶促进剂：非微生物生长所必须，可以促进产酶，但作用机理未阐明的物质。4.添加产酶促进剂（二）遗传控制（内因）——突变株组成型突变株：调节基因或操纵基因发生突变，解除诱导酶的生成对诱导物的依赖的突变株。营养缺陷型菌株：突变导致了某酶合成能力的丧失，末端产物不能积累，解除了其反馈阻遏作用，加入末端产物即可正常生长。抗反馈阻遏突变菌株：调节基因或操纵基因发生突变，产生的调节蛋白与产物不能结合，或结合但不发生作用

第四节酶发酵动力学发酵动力学：研究发