基因工程DNA文库的构建

第十一章DNA文库的构建和

目的基因的筛选基因组DNA文库：将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。cDNA文库：若这些阳性菌落中所含的外源DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，则称之为cDNA文库。现在是1页\一共有50页\编辑于星期三现在是2页\一共有50页\编辑于星期三现在是3页\一共有50页\编辑于星期三构建基因文库的基本程序：提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；阳性重组菌落或噬菌斑的选择。现在是4页\一共有50页\编辑于星期三第一节基因组DNA文库的构建一、基因组DNA文库的类型和发展质粒文库噬菌体文库黏粒文库人工染色体文库亚基因组文库现在是5页\一共有50页\编辑于星期三鸟枪法（霰弹法）：利用机械剪切力和超声波等物理方法或限制性核酸内切酶酶切等生化方法将生物chr.打断，随后通过T4DNA连接酶把这些片段与适当的质粒载体进行重组，转化受体菌后进行无性繁殖，获得一大群含不同外源DNA片段的克隆，再用简便的筛选方法从众多的转化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌株，从中获得所要的基因。现在是6页\一共有50页\编辑于星期三代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。文库构建策略：①采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体DNA，以保证克隆的随机性，保证每段DNA在文库中出现的频率均等；②提高文库所含基因组DNA的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。二、文库的代表性和随机性现在是7页\一共有50页\编辑于星期三三、基因组DNA文库构建流程载体的制备；高纯度大分子量基因组DNA的提取；HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGEsizeselection）；载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；重组克隆的挑取和保存。现在是8页\一共有50页\编辑于星期三现在是9页\一共有50页\编辑于星期三1．基因组DNA文库的载体制备

载体的制备要求：①纯度高；②去磷酸化好。2．高质量大分子量基因组DNA的提取和部分酶切

提取的基因组DNA要求保存完整。分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。3．文库的连接转化或包装侵染

在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化效率高的感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白；同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的DNA的转化效率也有所不同。现在是10页\一共有50页\编辑于星期三4．文库的质量检测

文库的平均插入片段长度是通过PFGE电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。美国的研究机构对BAC文库，一般要求植物的在130kb左右，而动物的在150kb左右。插入效率：有插入片段的克隆在所有检测的克隆中所占的比例。基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度×克隆数/基因组DNA的长度（一般是约数）；

基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数又等于所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比值

现在是11页\一共有50页\编辑于星期三第二节cDNA文库的构建

cDNA文库中的外源DNA片段是互补DNA（complementaryDNA,cDNA）。cDNA是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的双链cDNA。cDNA文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。cDNA文库构建步骤：细胞总RNA的提取和mRNA分离；第一链cDNA合成；第二链cDNA合成；双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。现在是12页\一共有50页\编辑于星期三现在是13页\一共有50页\编辑于星期三

mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库和其它应用所必需进行的步骤。

目前mRNA的纯化方法：在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]链，由它与mRNA的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA，进而将mRNA从其它组分中分离出来。

1．mRNA的完整性指导合成高分子量蛋白质的能力；指导合成目的多肽的能力（利用免疫共沉淀和SDS）；mRNA的大小（500bp-8kb，多数1.5-2kb）；总mRNA制剂指导合成cDNA第一链长分子的能力。一、mRNA的分离现在是14页\一共有50页\编辑于星期三3．mRNA的富集

3.1按大小对mRNA进行分级分离

3.2cDNA的分级分离

近年来多采用此方法，特别是大mRNA，可避免降解mRNA,agarose分离大小易辨。

3.3多聚核糖体的免疫学纯化法

用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体。

免疫亲和柱/A蛋白-Sepharose柱，单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到A蛋白-spharose柱上，随后用EDTA解离下来，通过oligo（dT）层析分离mRNA。此法分离的mRNA只占总mRNA的0.01-0.05%。2．mRNA的丰度

高丰度mRNA：在特定细胞中占50-90%，如：免疫球蛋白。

低丰度mRNA：含量＜0.5%被称为低丰度或稀有mRNA。现在是15页\一共有50页\编辑于星期三二、cDNA第一链的合成常用的反转录酶：AMV（来自禽成髓细胞瘤病毒）MMLV（来自Moloey鼠白血病病毒）依赖于RNA的DNA聚合酶，有5'--3'DNA聚合酶活性。合成DNA常用的引物：Oligo（dT）和随机引物。Oligo（dT）引物一般包含10～20个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成，随机引物一般是包含6～10个碱基的寡核苷酸短片段。现在是16页\一共有50页\编辑于星期三

Oligo（dT）引导的cDNA合成是在cDNA的合成过程中加入高浓度的Oligo（dT）引物，Oligo（dT）引物与mRNA的3‘末端的poly（A）配对，引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA。这种cDNA合成的方法在cDNA文库构建中应用极为普遍，其缺点主要是由于cDNA末端存在较长的poly（A）而影响cDNA测序。

随机引物引导的cDNA合成是采用6－10个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定mRNA并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条mRNA链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的mRNA分子的5'-端序列。随机引物cDNA合成的方法不适合构建cDNA文库，一般用于克隆特定mRNA的5'末端，如RT-PCR和5'-RACE。现在是17页\一共有50页\编辑于星期三1．自身引导法：

首先用氢氧化钠消化杂合双链中的mRNA链，解离的第一链cDNA的3‘-末端就会形成一个发夹环（发夹环的产生是第一链cDNA合成时的特性，原因至今未知，据推测可能是与帽子的特殊结构相关），并引导DNA聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的，再利用S1核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断形成平端结构可以进行连接。三、cDNA第二链的合成现在是18页\一共有50页\编辑于星期三现在是19页\一共有50页\编辑于星期三2．置换合成法：RNaseH：将mRNA－cDNA杂合双链中的mRNA链切割成很多的小片段；大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：以形成的小片段为引物，以第一链cDNA为模板合成一段段互补的cDNA片段。DNA连接酶：合成的这些小cDNA片段被连接成一条链。现在是20页\一共有50页\编辑于星期三现在是21页\一共有50页\编辑于星期三3．引导合成法：

本方法是Okayama和Berg1982提出的。首先是制备一端带有Poly（dG）的片段Ⅱ和带有Poly（dT）的载体片段Ⅰ，并用片段Ⅰ来代替Oligo（dT）进行cDNA第一链的合成，在第一链cDNA合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，同时进行酶切创造出另一端的粘端，与片段Ⅱ一起形成环化体，这种环化了的杂合双链在RNaseH、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶的作用下合成与载体联系在一起的双链cDNA。其主要特点是合成全长cDNA的比例较高，但操作比较复杂，形成的cDNA克隆中都带有一段Poly（dC）/（dA），对重组子的复制和测序都不利。现在是22页\一共有50页\编辑于星期三现在是23页\一共有50页\编辑于星期三现在是24页\一共有50页\编辑于星期三4．引物－衔接头合成法第一链合成后直接采用末端转移酶在第一链cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，然后用一段带接头序列的Poly（dG）短核苷酸链作引物合成互补的cDNA链，接头序列可以是适用于PCR扩增的特异序列或用于方便克隆的酶切位点的序列。这一方法目前已经发展成PCR法构建cDNA文库的常用方法。现在是25页\一共有50页\编辑于星期三现在是26页\一共有50页\编辑于星期三现在是27页\一共有50页\编辑于星期三现在是28页\一共有50页\编辑于星期三现在是29页\一共有50页\编辑于星期三现在是30页\一共有50页\编辑于星期三

cDNA克隆时常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长cDNA克隆。cDNA克隆中,得到了不完整的片段,可采用此方法获得3‘末端和5’末端的序列。工作原理见后图。筛选文库时一般只能回收一个或几个cDNA克隆，而RACE可产生大量独立克隆。引物GSP1根据已经得到的不完整的cDNA的序列设计。（3）RACE（randomamplificationofcDNAends）

现在是31页\一共有50页\编辑于星期三现在是32页\一共有50页\编辑于星期三现在是33页\一共有50页\编辑于星期三第三节基因克隆的筛选策略一般来说，这一筛选过程的难易程度，主要取决于所采用基因的克隆方案和目的基因的性质与来源。从文库中筛选目的基因的方法主要有：核酸杂交法、特异性抗原的免疫学检测法、PCR筛选法。基因克隆的本质：从文库中筛选目标克隆，重点在筛选。常见筛选工具：探针（probe）狭义：核酸，抗体广义：还包括其他筛选手段。现在是34页\一共有50页\编辑于星期三

生物体的表型特征由控制其性状的基因编码。因此，可以通过观察表型的变化来筛选目的基因。表型筛选法就是根据目的基因编码比较特殊的功能，并且载体的帮助下可以在宿主菌（如大肠杆菌）中表达该基因，表现出其特殊的功能所决定的表型性状来，这样就很容易通过导入的基因带来新的功能或恢复其缺失的功能来确定目的基因。一、表型筛选法抗性基因：抗生素抗性基因、抗重金属抗性基因分解基因：苯环化合物、分解酶功能活性：杀虫、酶启动子/复制子：功能缺失：在获得相应突变体的前提下，以此突变体作为宿主，将野生型的DNA导入后检测回复突变（如：营养缺陷型相关的基因）。现在是35页\一共有50页\编辑于星期三现在是36页\一共有50页\编辑于星期三

当目标基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表达的真核生物的基因，可以利用的可能只是该基因的部分序列、同源基因片段或不完整的蛋白质产物，此时就必须考虑其它的方法来筛选。杂交筛选法是应用最为广泛的筛选目标基因克隆的一种方法。二、杂交筛选同源DNA探针：高度保守的基因rRNA基因邻近种属的相应基因相应基因的序列比较合成寡核苷酸：蛋白质N-末端aa序列简并探针根据密码子的使用频率，合成猜测体探针设计两组简并探针，用第二个探针对第一次筛选的阳性克隆子作第二次杂交现在是37页\一共有50页\编辑于星期三实验组mRNA&对照组mRNA

↓分别制备探针（mRNA或cDNA)

↓

分别筛选含目的基因的cDNA文库

↓

阳性菌落x光底片显色

↓

比较x光底片和对照平板，挑出含目的基因的菌落

↓鉴定目的基因(一)差别杂交(differentialhybridization

)优点--简便、直观缺点--敏感性不高，难以获得低丰度差异表达基因--膜杂交筛选工作量大，信号强度可比性不佳现在是38页\一共有50页\编辑于星期三实验组mRNA&对照组mRNA

↓反转录为单链cDNA（量少）生物素标记mRNA（量多）

↓

杂交(约1:20)生物素标记mRNA：cDNA杂合子

↓

与链球菌抗生物素蛋白进行交联反应生物素标记mRNA：cDNA杂合子交联于链球菌抗生物素蛋白上

↓

去双链结构

↓单链cDNA

↓制备差减探针&

构建差减cDNA文库

↓差减cDNA文库筛选

↓鉴定目的基因(二)mRNA减法杂交（subtractivehybridization)现在是39页\一共有50页\编辑于星期三原理：SSH是差减杂交与PCR结合的简单、快速分离差异基因的方法。其运用杂交动力学原理，即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使不同丰度的单链DNA得到均衡；抑制PCR则利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构,无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。（三）抑制性差减杂交(suppressivesubtractivehybridization,SSH)现在是40页\一共有50页\编辑于星期三方法：提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA，经识别4碱基的限制性内切酶切割；实验组cDNA平均分为2份，分别连接2个接头；进行2轮差减杂交和抑制PCR；获得富集的目的基因。现在是41页\一共有50页\编辑于星期三检测组(Tester)—含目的基因cDNA，加接头驱逐组(Driver)—不含目的基因cDNA，不加接头*接头含PCR引物正向SSH:易感者(Tester)+不易感者(Driver)易感者特异表达或高表达基因反向SSH:不易感者(Tester)+易感者(Driver)不易感者特异表达或高表达基因优点：采用两次差减杂交和两次PCR，保证了高特异性(假阳性率可降至6％);在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，从而获得低丰度差异表达基因;操作相对简便，是目前分离新基因的主要方法。缺点：起始材料需要g级量mRNA;SSH差减克隆片段较小，获取cDNA全长序列有一定难度。现在是42页\一共有50页\编辑于星期三三、免疫筛选

免疫筛选法和核酸杂交的方法类似，只是其使用的探针不是核酸，而是特异性的抗体。适合免疫杂交法筛选的外源基因首先要在宿主细胞中存在抗原蛋白的表达，用于筛选的DNA文库必须是表达文库，通常是原核生物的基因组DNA文库和真核生物的cDNA表达文库。而且，所检测的对象为宿主中不编码的基因或宿主中缺失表达的基因。

四、高表达基因高丰度mRNA，如用苯肼做了贫血处理的兔网织红细胞中，血红蛋白mRNA的含量占绝大多数现在是43页\一共有50页\编辑于星期三mRNA3’末端有12种可能的序列；以此12种引物引导cDNA第一链合成；以10nt随机引物引导cDNA第二链合成，可产生50-100条100-500bp的条带；12种锚定引物和20种随机引物组成240组引物，产生约20000种DNA条带。五、mRNA差别显示现在是44页\一共有50页\编辑于星期三现在是45页\一共有50页\编辑于星期三酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在