化学液相色谱质谱联用仪的原理及应用

化学液相色谱质谱联用仪的原理及应用第1页/共73页2色谱-质谱联用仪色谱的分离能力质谱的定性功能实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。第2页/共73页3色谱质谱联用的接口接口：是将色谱仪与质谱仪直接联接起来的装置。作用：将通过色谱仪分离开的各种组分逐一送入质谱仪中进 行分析。接口要协调前后两种仪器的输出和输入间的 矛盾。将两种仪器的分析方法结合起来，协同作用， 取长补短，获得单独使用时所不具备的功能。因此，接口是色谱质谱联用技术中的关键装置。第3页/共73页4色谱质谱联用的分类

气相色谱-质谱联用：开发最早的色谱联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物。

液相色谱-质谱联用：液相色谱-质谱联用的接口问题得到解决，近年有了飞速发展。适宜分析大分子（包括蛋白、多肽多聚物等）、不挥发、热不稳定、极性的化合物。

毛细管电泳-质谱联用：近年发展迅速，特别对生物大分子的分类分析十分有用。第4页/共73页5质谱仪包括真空系统、进样系统、离子源、质量分析器、检测器和数据处理系统。真空系统VacuumSystem进样系统SampleInlet检测器Detector数据处理系统DataSystem质量分析器MassAnalyser离子源IonizationSource质谱仪第5页/共73页6质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须处于高真空状态。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。一般质谱仪都采用机械真空泵（前级低真空泵）预抽真空，再用高效率油扩散泵或分子涡轮泵（高真空泵）连续地运行以保持真空。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达检测器，真空度不够则灵敏度低。真空系统第6页/共73页7进样系统是将分析样品引入到离子源的装置。进样方式：1直接进样2仪器联用的进样（GC、LC、CE）

进样系统第7页/共73页8色谱-质谱联用仪的接口和色谱仪组成了质谱的进样系统。接口应满足：1.接口的存在既不破坏离子源的高真空，也不 影响色谱柱的分离柱效；2.接口应能使色谱分离后的各组分尽可能多的进入质谱仪的离子源，同时使色谱流动相尽可能的不进入质谱的离子源；3.接口的存在不改变色谱分离后各组分的组成和结构。仪器联用的进样第8页/共73页9

离子源将欲分析样品的原子或分子电离，得到带电离子，并对离子进行加速使其进入质量分析器。根据电离方式的不同，常用的有:离子源电子轰击电离源electronimpactionizationsource,EI化学电离源chemicalionizationsource,CI快原子轰击电离源fastatombombardmentsource,FAB电喷雾电离源electrosprayionizationsource,ESI大气压化学电离源atmosphericpressurechemicalionizationsource,APCI基质辅助激光解析电离源Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization,MALDI第9页/共73页10EI源应用最为广泛，特别是气相色谱-质谱联用仪中应用最多的离子源，它主要用于挥发性样品的电离。原理：由进样系统进入的气体样品到达离子源，与灯丝发出的电子发生碰撞使样品分子电离。电子轰击电离源EI电子轰击电离源示意图第10页/共73页11特点：谱图简单，最强峰为分子离子峰和准分子离子峰，碎片离子峰很少。可用于负离子质谱，多数有机化合物的负离子CI质谱图灵敏度要比其正离子的CI质谱图高2-3个数量级。不适用难挥发试样。++气体分子试样分子+准分子离子电子化学电离源CICI源原理：利用反应气体的离子和样品分子发生分子-离子反应而生成样品分子离子。化学电离源示意图第11页/共73页12快原子轰击电离源FABFAB源原理：氩气被电子轰击而电离，生成的氩离子被电子透镜聚焦并加速生成动能可控的离子束，经过中和器中和掉离子束所带的电荷，成为高速定向运动的中性原子束，用此原子束轰击样品使其电离。特点：适用于分析大分子量、难气化、热稳定性差的样品。快原子轰击电离源示意图第12页/共73页13特点： 1.是一种软电离方式，适于分析极性强的有机化合物。

2.容易形成多电荷离子，可以测量大分子量的蛋白质。

3.主要应用于液相色谱-质谱联用仪。电喷雾电离源ESIESI源原理：流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；从而雾化、蒸发溶剂、阻止中性溶剂分子进入后端检测。电喷雾电离源示意图第13页/共73页14大气压化学电离源APCICoronaNebulizer

APCIHPLCinlet+++++APCI源原理：喷嘴下游放置一个针状放电电极，进行高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+

和O+

等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与样品分子进行离子-分子反应，使样品分子离子化。特点：

属于“软”电离方式，适于分析质量数小于2000u的弱极性小分子化合物。只产生单电荷离子，主要是准分子离子，很少有碎片离子。主要应用于液相色谱-质谱联用仪。大气压化学电离源示意图第14页/共73页15

MALDI适用于生物大分子，如肽类，核酸类化合物。可得到准分子离子峰，碎片离子和多电荷离子较少.基质辅助激光解析电离源MALDIMALDI源原理：待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。基质辅助激光解析电离源示意图第15页/共73页16质量分析器是质谱仪的核心,质量分析器的作用是将离子源产生的离子按m/z顺序进行分离并排列。

常用的质量分析器有：磁质量分析器（MagneticSectorAnalyzer）

四极杆质量分析器（quadrupolemassanalyzer）飞行时间质量分析器（timeofflight,TOF）离子阱质量分析器（iontrap）质量分析器第16页/共73页17磁质量分析器是根据离子束在一定场强的磁场中运动时，其运动的曲率半径与离子的质荷比和加速电压有关。是质谱仪中最早使用的质量分析器。分为单聚焦磁质量分析器和双聚焦磁质量分析器。磁质量分析器单聚焦磁质量分析器示意图双聚焦磁质量分析器示意图特点：单聚焦磁质量分析器分辨率低，双聚焦磁质量分析器分辨率很高。第17页/共73页18传统的四极杆质量分析器是由四根笔直的棒状电极与轴线平行并等距离的置悬着构成，棒的理想表面为双曲面。在一定DC/VC作用下，只有m/z满足一定要求的离子才能通过四极杆到达检测器，其他离子被滤掉。四极杆质量分析器四极杆质量分析器具有重量轻、体积小、造价低廉等优点。++++四极杆质量分析器示意图第18页/共73页19用一个脉冲将离子源中的离子瞬间引出，经加速电压加速，它们具有相同的动能进入漂移管，质荷比小的离子具有最快的速度因而首先到达检测器，质荷比大的离子则最后到达检测器。配离子反射镜的飞行时间质谱示意图飞行时间质量分析器特点：

1）检测离子的质荷比范围非常宽；

2）灵敏度高，适合于作串联质谱的第二级；

3）扫描速度快，适合研究极快过程。第19页/共73页20离子阱与四极质量分析器的原理类似，当高频电压幅值和高频电压频率固定为某一值时，只能使某一质荷比的离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器。离子阱质量分析器特点：单一的离子阱可实现多极“时间上”的串联质谱；结构简单、价格便宜，性价比高；灵敏度高；质量范围大。第20页/共73页21检测器质谱仪常用的检测器有直接电检测器、电子倍增器、闪烁检测器和微通道板等。电子倍增器运用质量分析器出来的离子轰击电子倍增管的阴极表面，使其发射出二次电子，再用二次电子依次轰击一系列电极，使二次电子获得不断倍增，最后由阳极接受电子流，使离子束信号得到放大。电子倍增器示意图第21页/共73页22数据处理系统质谱仪都配有完善的计算机系统，不仅能快速准确的采集数据和处理数据，而且能监控质谱仪各单元的工作状态，实现质谱仪的全自动操作，并能代替人工进行化合物的定性和定量分析。第22页/共73页23质谱谱图质谱图： 以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子 质荷比为横坐标所作的图就是质谱图。质荷比：

离子质量（以相对原子量单位计）与它所带电荷 （以电子电量为单位计）的比值，写作m/z

。峰：

质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰。离子丰度：

检测器检测到的离子信号强度。基峰：

在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子 峰称作基峰。第23页/共73页24质谱谱图m/z丰度基峰:

谱图中最强的离子[M+H]+假分子离子或准分子离子A+1A+2

来源于自然界中同位素{第24页/共73页25分子离子：

样品分子失去一个电子而形成的单电荷离子，它 代表样品的分子量。准分子离子： 指与分子存在简单关系的离子，通过它也可以确 定分子量。液质中最常见的准分子离子峰是 [M+H]+，[M-H]–，[M+Na]+等。碎片离子： 分子离子或准分子离子裂解生成碎片离子，碎 片离子还可能进一步裂解成质量更小的碎片离 子，碎片离子是解析质谱图，推断分子结构的 重要信息。质谱中的离子第25页/共73页26

质谱中的离子母离子与子离子：任何一个离子进一步裂解为质荷比较小的离 子，前者是后者的母离子或前体离子，后者是 前者的子离子。同位素离子： 由元素的重同位素构成的离子。各种元素的同 位素基本上按照其在自然界的丰度比出现在质 谱中，有利于确定化合物及碎片的元素组成。亚稳离子： 由离子源到检测器的飞行途中裂解的离子。可 以指示离子产生的途径，对结构判断很有用。第26页/共73页27

质谱中的离子单电荷离子： 带有1个电荷的离子，z=1。多电荷离子： 带有2个或更多电荷的离子，如z≥2。奇电子离子（OE）：带未成对电子的离子，以符号“+·”表示。偶电子离子（EE）：外层电子完全成对的离子，以符号“+”表示。第27页/共73页28液相色谱-质谱联用液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术的研究开始于20世纪70年代，直到90年代才出现被广泛接受的商品接口及成套仪器。液相色谱一般在常压下工作除了真空匹配之外，液质联机技术发展可以说就是接口技术的发展。质谱的工作要求高真空系统LC-MS联用首先要解决的问题是真空的匹配。第28页/共73页29液相色谱-质谱联用接口的发展20世纪70年代 直接液体导入接口（DLI） 移动带技术（MB）20世纪80年代 热喷雾接口（TS） 粒子束接口（PB） 快原子轰击接口（FAB）20世纪90年代 基质辅助激光解析接口（MALDI）

电喷雾电离接口（ESI） 大气压化学电离接口（APCI）第29页/共73页30DLI： 是在真空泵的承载范围内，以细小的液流直接 导入质谱。优点：是液质方法的最简单的接口，造价低廉。缺点：无法在大流量下工作； 喷口易堵塞。直接液体导入接口DLI此方法始终停留在实验室使用阶段，没有真正形成商品化仪器。第30页/共73页31MB： 是在LC柱后增加一个传送带，柱后流出物滴落 在传送带上，经红外线加热除去大部分溶剂后进 入真空室，传送带依据流动相的组成调整移动速 度。优点：基于溶剂和样品的沸点差别进行分离，可被用于 大部分有机物的质谱分析。缺点：不适于分析高沸点、难挥发的化合物； 离子化效率低； 灵敏度低； 移动带上残存的难挥发物质易造成记忆效应而干 扰分析。移动带技术MB第31页/共73页32TS： 喷雾探针取代直接进样杆，流动相经过喷雾针 时被加热到低于完全蒸发点5-10℃，体积膨胀 后以超声速喷出探针形成雾状混合物。优点：可适应较大流速和含水较多的液相流动相。缺点：分子量局限于200-1000u的化合物； 对热稳定性较差的化合物有比较明显的分解作 用。热喷雾接口TS第32页/共73页33FB： 又称动量分离器。流动相及样品被喷雾成气 溶胶，脱去溶剂后在动量分离器内产生动量 分离，而后经一根加热的转移管进入质谱。优点：离子化由质谱的EI或CI方式进行，可以获得 经典的质谱图。缺点：由于离子化手段仍为电子轰击，不是软离子 化方式，因此不适于分析热不稳定化合物； 主要用于分析非极性或中等极性的、分子量 小于1000u的化合物。粒子束接口FB第33页/共73页34FAB：快原子轰击电离源优点：是“冷”离子源，适于分析热不稳定、难气化 的化合物，尤其是对肽类和蛋白质分析的有 效性在电喷雾接口出现前是其它接口无法相 比的。缺点：混合物样品中共存物质干扰抑制样品分子的 离子化，造成灵敏度下降； 只能在低流量下工作，严重限制了液相柱的 分离效果。快原子轰击FAB第34页/共73页35基质辅助激光解析MALDIMALDI：基质辅助激光解析电离源优点：特别适合与飞行时间质谱联用，可测分子量 范围高达上百万u，并且具有很高的灵敏 度。缺点：与FAB相同，混合物样品中共存物质的干扰 也很明显，造成质谱信号很弱或根本没有， 灵敏度下降。第35页/共73页36电喷雾电离ESIESI：电喷雾电离源特点：应用范围广泛；离子化效率高，对蛋白质而言接近100%；多种离子化模式供选择：ESI（+）、ESI（-）；可产生多电荷离子，适于测量大分子量的蛋白质；属于“软”离子化模式，可分析热不稳定化合物。第36页/共73页37大气压化学电离APCIAPCI：大气压化学电离源特点：属于“软”电离方式，适于分析质量数小于2000u的弱极性小分子化合物；多种离子化模式供选择：APCI（+）、APCI（-）；只产生单电荷离子，主要是准分子离子，很少有碎片离子。第37页/共73页38实验室现有的液相色谱-质谱联用仪类型：液相色谱-质谱联用仪（1100LC-MSDTrapXCT，Agilent，科学楼7楼）三重四极杆质谱联用仪（TSQQuantumAccessMAX

，ThermoFisher，科学楼8楼）微流控芯片液相质谱串联仪（1260LC,1200NanoHPLC-Chipcube-QTOF6520，Agilent，科学楼8楼）液相色谱-质谱联用仪第38页/共73页39在线真空脱气机

二元或四元梯度液相泵

自动进样器

柱温箱二极管阵列检测器液相色谱-质谱联用仪（1100LC-MSDTrapXCT）离子阱质谱仪第39页/共73页40ESI电离源APCI电离源离子源：ESI和APCI第40页/共73页41什么是

MSn?

该方式是表明多级离子分离和碎裂步骤可产生离子质谱图。

n=分离和碎裂步骤数目，最小是1（最后一步是全扫描).e.g.MS3

意义

1)一个母离子的分离和碎裂

2)由前级碎裂得到的子离子的分离和碎裂

3)全扫描质谱分析质量分析器：离子阱（iontrap）第41页/共73页42

累积第一级离子分离第一级离子碎裂第二级离子分离第二级离子碎裂第三级质谱分析MassA+A1+A2+A3+A4+A2+A11+A21+A31+A41+A11+A21+A31+A41+MS1MS2MS3MS3的图解第42页/共73页43易懂、易用、图型化的控制及分析软件第43页/共73页441.天然产物鉴定；2.生物制药及药物代谢分析；3.食品成分分析；4.蛋白质及多肽分析；5.农药及兽药残留分析。应用范围第44页/共73页45样品要力求干净，不含显著量的杂质，尤其是与分析无关的蛋白质和肽类；2.不含有高浓度的难挥发酸（硫酸、磷酸等）及其盐；3.样品粘度不能过大，防止堵塞柱子、喷口及毛细管入口。送样要求第45页/共73页46检测器

自动进样器

柱温箱四元梯度液相泵三重四极杆质谱仪三重四极杆质谱联用仪（TSQQuantumAccessMAX）第46页/共73页47离子源：HESI-II和APCI加热电喷雾离子源（HESI-II）是采用电喷雾电离与加热辅助气相结合的方法，将溶液中的离子转换成气相中的离子。可分析所有在溶液中能预形成离子的极性化合物。HESI-II电离源探针离子源室APCI电离源探针第47页/共73页48进样方式直接进样： （使用注射泵）LC液流不经过色谱分离：自动定量环进样至LC液流（使用注 射泵）； 手动定量环进样至LC液流； 进样至LC液流（使用注射泵）； 自动进样器进样至LC液流LC流路经过色谱分离： 自动进样器经LC液流进样到色谱柱第48页/共73页49Q1和Q3Q2质量分析器：三重四极杆（TSQ）质量分析仪、离子探测系统和离子光学组件TSQ上的质量分析仪包含三个四级杆组件（Q1、Q2和Q3）以及三个透镜组。第49页/共73页50扫描模式一、子离子扫描第50页/共73页51扫描模式二、母离子扫描第51页/共73页52扫描模式三、中性丢失扫描第52页/共73页53扫描类型一、全扫描在指定的扫描时间内，质量分析仪不间断地从第一个质量数扫到最后一个质量数，提供分析物的完整质谱，用于确认未知化合物。二、选择的离子监控（SIM）可监控某个离子或一组离子，适用于已知目标化合物分析，探测复杂混合物中的微量目标化合物时很有用。三、选择反应监控（SRM）可监控某个反应或几组反应，如离子的裂解或中性基团丢失。四、自动SIM质谱仪会在预扫描中自动选择最强烈的m/z值，为它们建立一个SIM扫描列表，然后采集和记录这些选定质量的离子。可在任何模式中的全扫描上执行。第53页/共73页54控制及分析软件Xcalibur第54页/共73页55控制及分析软件LCquan第55页/共73页56应用范围可同时对复杂基质样品进行多残留和定量实验，提供无与伦比的低浓度定量表现，并佐以快速，高特异性的全二级谱图扫描进行确认。该仪器主要应用于制药、环保、食品安全、临床和法医学等多种领域。第56页/共73页57送样要求样品必须是澄清溶液，不能有显著的杂质，需过滤(0.45μm滤膜)；2.样品不能含有难挥发酸，强酸、强碱，盐，表面活性剂及ContaminationPeak表上的物质；3.所用溶剂一般为水、乙腈和甲醇，且溶剂需过滤(0.45μm滤膜)。

4.优化时标准品浓度一般为1-5ppm；测样时样品浓度一般为10-3ppm，不要超过0.1ppm。第57页/共73页58微流控芯片液相质谱串联仪（1260LC,1200NanoHPLC-Chipcube-QTOF）飞行时间质谱仪微流控芯片1260LC1200NanoHPLCChipCubeonQTOF第58页/共73页59进样方式直接进样1260LC进样1200NanoHPLC进样Chipcube进样第59页/共73页60离子源：ESIAgilent离子源是气动辅助源，可以处理高液体流量。QTOF使用的是双喷雾电喷雾源。ESI电离源示意图分析雾化器参比雾化器第60页/共73页61质量分析器：QTOFQTOF真空系统第61页/共73页62扫描方式一级质谱 T