免疫组织化学分析

免疫组织化学分析第一页，共三十页，2022年，8月28日第一部分基本知识第二页，共三十页，2022年，8月28日免疫组织化学的历史、现状和发展

疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、更可信、更有权威性。1974年免疫组化用于病理诊断免疫组织化学已成为病理诊断中的一种常用手段随着免疫学和单抗技术的发展，免疫组化技术兴起诊断免疫组化开始于70年代，发展高峰在80年代，90年代已在国外病理科列入病理技术室的常规工作。国内病理科约晚10年的进程，90年代开始在诊断病理工作中普及第三页，共三十页，2022年，8月28日免疫组织化学在临床上的应用(1)提高病理诊断准确性(2)对疾病的预后和治疗的意义激素(3)癌基因蛋白的应用(4)对肿瘤增生程度的评价(5)微小病灶的发现微小癌，微小病灶（如羊水栓塞）(6)在肿瘤分期上的意义(7)指导肿瘤的治疗(8)免疫性疾病的辅助诊断(9)病原微生物的检测第四页，共三十页，2022年，8月28日免疫组化与抗体鉴定抗体上游鉴定方法:存在否?量多少?

免疫印迹、免疫沉淀、免疫电泳、免疫酶连抗体下游鉴定方法:价值体现IIF:间接免疫荧光技术,系IF的一种,步骤很简单,特点为敏感性好,对于低浓度抗体检出率高于以下两种方法.IHC:免疫组织化学技术,方法不少,但具体操作基本相同,掌握一种就够用了。ICC:免疫细胞化学技术,同上，组织换成细胞，但是处理方法不一样了。下页图示第五页，共三十页，2022年，8月28日免疫组化的各种方法第六页，共三十页，2022年，8月28日IHC技术是目前常规病理诊断和临床治疗中必不可少的手段，按照美国FDA标准，IHC抗体试剂系统分三类：A类抗体进行病理鉴别诊断，B类抗体指导临床治疗，如ER/PR和AR，C类抗体显示临床用药的靶细胞，要求试剂的安全性和稳定性很高，此类抗体筛选要求有严格的内部和外部对照。第七页，共三十页，2022年，8月28日免疫组化实验涉及的几个方面

1病理医师：把握和选择，指导实验结果判定，2实验员：准备片子和试剂，了解基本原理也很重要，会做也要会分析3组织处理4试剂是否可靠，实验方法是否正确5实验对照设立：许多实验室忽略了这个要素。第八页，共三十页，2022年，8月28日第二部分实验技术第九页，共三十页，2022年，8月28日免疫组化染色基本技术正式实验前做HE染色确认片子质量，厚度3-4um，目的细胞形态完好，没有过多的坏死、出血、变性组织等，以免实验完毕后发现片子质量不好，浪费试剂和物力1常规处理：烤片，脱蜡，入水2抗原修复：3封闭处理：封闭组织内源性酶，封闭组织非特异性抗原结合位点，其他封闭4抗体反应：一抗，二抗，三抗5显色反应：DAB，AEC，BCIP/NBT6后续处理：复染/分化/返兰，脱水，透明，封片相关知识：HE染色第十页，共三十页，2022年，8月28日相关知识：HE染色苏木素—伊红染色是形态学常用的染色方法，取自Hematoxyln和Eosin单词，简称HE染色，苏木素将细胞核染成蓝色，伊红将细胞浆染成红色，显示组织和细胞形态结构，同时将各种组织细胞成分与病变区分开来。HE染色是临床病理诊断的方法。HE与IHC配合可以确诊疾病第十一页，共三十页，2022年，8月28日相关知识：HE示意图第十二页，共三十页，2022年，8月28日相关知识：HE与IHC染色第十三页，共三十页，2022年，8月28日（一）

良好的标本制备，免疫组化成功的首要条件免疫组化对组织和细胞标本的要求

-保持所检标本原有的结构、形态；

-在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。免疫组化中常用的组织和细胞标本

*组织标本*细胞标本

石蜡切片组织印片冰冻切片细胞涂片

细胞爬片

第十四页，共三十页，2022年，8月28日

*石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法

-最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；这点对于我们来说非常重要！

-石蜡块还能长期存档，供回顾研究。

*石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。第十五页，共三十页，2022年，8月28日切片的准备：APES，多聚赖胺酸刚切的石蜡片至少在58-60℃考2h以上（防止脱片），可以放置一段时间，实验前再烤30min即可。不可高温烤片（80℃），会导致组织抗原氧化而难以检测。切片保存：不可长时间室温或冰箱里保存切片，抗原会丢失，原则上切片最多可放3个月。背景：有些研究人员或技术员喜欢一次性连续切上大量片子，然后放置保存，留做实验

第十六页，共三十页，2022年，8月28日

常规的石蜡切片标本均用甲醛（福尔马林）固定，结果使得：

-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；

-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。*要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

因为石蜡片组织含有石蜡，并且组织处于脱水的状态，所以在实验前期要进行相应处理，即二甲苯脱蜡和梯度酒精水化（从无水乙醇逐渐下行到75%酒精的过程，入水）下一步：抗原修复第十七页，共三十页，2022年，8月28日（二）

恰当的抗原修复，会很大程度上改变最终的实验结果抗原修复方法

化学方法：胃蛋白酶，胰蛋白酶

加热方法

-水浴加热法

-微波照射法

-高压加热法

酸水解法以抗原修复效果而言，高压法﹥微波法﹥化学方法﹥酸水解法﹥水煮法

细胞片和冰冻切片不需要抗原修复，但需要封闭步骤第十八页，共三十页，2022年，8月28日

微波法

*将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。高压法

*将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压1～2min，可取得极好的效果。

*由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。

注意事项

加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；

*修复液最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液；

下一步；封闭处理

第十九页，共三十页，2022年，8月28日（三）

封闭处理，降低非特异性染色的必要程序这个步骤在抗原修复之后，主要有三个封闭如果最后的显色系统采用HRP（辣根过氧化物酶），则需要以0.3-3%的H2O2封闭内源性过氧化物酶，否则组织中血液系统的细胞会干扰实验结果如果检测系统（二抗或者三抗）以生物素作为标记，则需要封闭内源性生物素（有专门试剂），否则肝、肾、甲状腺等组织容易出现假阳性。常规的非免疫血清（正常血清）封闭。下一步：抗体反应第二十页，共三十页，2022年，8月28日（四）

抗体反应，关键在于设置适当的对照1阴性对照：抗体稀释液2阳性对照：两个方面（阳性组织细胞、阳性抗体）3抑制对照4吸收对照5自身对照（内对照）6同型对照；同种属来源的纯IgG或其亚型7无关对照；其他抗体在病理科的日常诊断工作中，只要有阴性对照和阳性对照即可。第二十一页，共三十页，2022年，8月28日除一抗以外，配套的抗体检测试剂盒种类很多，这些试剂盒本身附带有详细的操作说明，如二步法、三步法等，同时会建议如何选择配套的显色系统。特殊类型的一抗，例如嵌合抗体，则选择特殊的配套试剂盒或二抗。即用型与浓缩型抗体关于一抗的孵育时间：

37℃1h4℃过夜可以根据实际需要安排

下一步；显色反应第二十二页，共三十页，2022年，8月28日（五）

显色系统与显色控制，决定实验效果目前最常用的显示剂显色试剂颜色

DAB棕黄色

AEC砖红色

AP-Red鲜红色

Fast-Blue亮绿色

BCIP/NBT兰色前两种用于辣根过氧化物酶（HRP）系统后三种用于碱性磷酸酶（AP）系统评价：AEC显色物溶于酒精和二甲苯，所以封片时不能用中性树胶，以免褪色，而只能用甘油明胶或市售的AEC封片剂，采用该种试剂显色的片子不能长期保存，不利于回顾性研究。

DAB显色较快，镜下控制比较容易，保存方便，实验结果比AEC显色者清晰，为IHC首选显色试剂。

BCIP/NBT显色系统主要用于原位分子杂交实验，免疫组化可以选用。其缺点是不能用苏木素复染（不能染核），但是可以用其他染料代替，比如核快红等。第二十三页，共三十页，2022年，8月28日三种显色系统效果图

左上AEC左下BCIP/NBT右DAB第二十四页，共三十页，2022年，8月28日（六）

显色后处理步骤，关系片子的外观和内观复染，分化，返兰前面已经强调过，石蜡片子在实验前经过了脱蜡和水化处理，即二甲苯先脱蜡，然后沿无水乙醇逐渐到75%酒精。实验完毕后，则必须沿着上面顺序反向走一遍，目的是脱水和透明，使得组织细胞清晰和易于保存，同时也去掉一些附着于片子上的杂质注意：适用于DAB和BCIP/NBT显色系统，AEC不可（？）。强调：整个实验过程不能干片第二十五页，共三十页，2022年，8月28日（七）

结果判断，实验是否成功的要素在对照实验的基础上进行判断结合抗体和患者的资料熟悉病理基本知识和病变特点真阳性与假阳性真阴性与假阴性第二十六页，共三十页，2022年，8月28日判断结果的基本原则阳性细胞定位是否明确，是胞膜、胞浆还是胞核阳性染色强度如何间质清晰，无背景着色。阳性细胞要在5%以上，才能定为阳性。参考评价：

<5%-5%-25%+25%-50%++>50%+++

第二十七页，共三十页，2022年，8月28日（八）

完整的IHC实验报告实验名称抗体名称、来源、亚型、克隆号检测的组织或细胞名称、来源、组织种属抗体的稀释度（