分子生物学实验流程及相关

分子生物学实验流程及相关第1页/共33页分子生物学实验概述生物样品（细胞、组织、细菌）细胞调节神经科学分子诊断DNA分离RNA分离质粒DNA噬菌体DNA基因组DNA总RNAmRNAcDNA重组DNAPCR遗传鉴定DNA测序DNA标记突变基因表达第2页/共33页分子生物学实验概述（续）基因表达报告基因载体基因转化报告基因检测真核转录体外转录翻译蛋白蛋白分析蛋白分离第3页/共33页分子生物学主要实验流程实验起始材料的选取和准备mRNA的提取、纯化目标片段的克隆和分析DNA、RNA的提取、纯化和分析克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析基因转化实验及转基因结果分析第4页/共33页实验起始材料的选取和准备常规材料组织器官原生质体\细胞细菌\真菌\酵母特殊材料少量起始材料特殊病变组织亚细胞结构第5页/共33页实验起始材料的选取和准备水稻卵细胞的分离分离准备工作材料的速冻长期保存人工气候箱、制冰机超净工作台、显微操作系统RNase-free耗材、液氮罐超低温冰箱RNase抑制剂第6页/共33页卵细胞mRNA的提取、纯化Oligotex系列试剂盒细胞裂解匀浆去蛋白和细胞残渣温浴并结合洗脱去盐和回收旋涡混匀器离心机恒温水浴锅离心机、旋涡混匀器200℃烘箱DEPC、RNase-freeDNaseI、RNase-free耗材第7页/共33页目标片段的克隆和分析利用SMARTcDNA文库构建试剂盒构建水稻卵细胞cDNA文库目标基因的获得通过噬菌体载体自切割或T-Vector、平末端载体克隆获得目标质粒利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因测序第8页/共33页通过SMART技术构建cDNA文库第一链的合成第二链的合成和扩增

酶切、纯化和片段分离cDNA检测插入载体并包装文库质量检测文库扩增及保藏恒温水浴锅、制冰机RTase、RNase抑制剂PCR仪高保真Taq酶恒温水浴锅、离心机限制性内切酶、过滤柱电泳仪器、凝胶成像系统琼脂糖恒温水浴锅超净工作台、烘箱、PCR仪培养基超低温冰箱DMSO第9页/共33页目标基因的克隆利用特异探针，通过核酸杂交的方法或利用特异的抗体，通过抗原-抗体反应进行文库目标基因的筛选利用GSP（基因特异引物）通过PCR扩增出目标基因通过5‘RACE和3’RACE克隆已知部分序列的目标基因第10页/共33页通过核酸杂交和免疫反应筛库将培养于平板的噬菌斑通过印迹转于尼龙膜，并于核酸交联仪中固定。在杂交箱中利用特定探针杂交。最后在恒温摇床中洗膜（探针标记：放射性和非放射性）将噬菌体培养于平板，于42℃培养几小时后，于37℃用IPTG诱导融合蛋白的表达并印记于尼龙膜上，利用抗原-抗体反应进行杂交第11页/共33页利用PCR技术获得目标基因利用GSP，以文库为模板通过PCR扩增出目标基因，并通过电泳、凝胶成像系统检测利用文库载体序列和已知的目标基因的序列设计通用引物和GSP，通过5’RACE和3’RACE扩增出目标基因的5’和3’端序列。并通过电泳、凝胶成像系统检测第12页/共33页DNA、RNA的提取、纯化和分析包含有目标基因的质粒的获得水稻基因组DNA的提取、纯化和分析水稻各器官TotalRNA的提取、纯化和分析第13页/共33页包含有目标基因的质粒的获得对于通过筛库技术获得的目标基因通过噬菌体载体的自切割作用生成目标质粒对于通过PCR技术获得的目标基因通过回收纯化后利用T载体等克隆并转化细菌铺板培养后通过蓝白斑，原位裂解杂交分离出含有目标质粒的单个菌落第14页/共33页对于通过PCR技术获得的目标基因PCR或RACE电泳凝胶成像系统长波紫外观察箱切胶胶回收试剂盒T载体、平末端载体转化细菌并铺板培养筛选目标菌落提取目标质粒第15页/共33页对于通过PCR技术获得的目标基因PCR或RACE琼脂水平电泳凝胶成像系统、手提紫外灯长波紫外观察箱PCR回收试剂盒胶回收试剂盒PCR仪电泳仪器恒温水浴锅、离心机Taq酶、薄壁管、矿物油琼脂糖第16页/共33页对于通过PCR技术获得的目标基因（续）纯化产物PCR产物测序T载体、平末端载体连接细菌转化、铺板培养蓝白斑筛选、菌落原位杂交质粒提取、酶切分析、测序测序仪低温冰箱杂交箱、恒温摇床、低温冰箱超净工作台、电转化仪离心机、恒温水浴锅感受态细胞、培养基、抗生素X-gal、IPTG、尼龙膜和探针限制性内切酶第17页/共33页质粒提取、分析常规质粒提取方法：通过细菌的适当裂解释放出质粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用无水乙醇沉淀质粒DNA质粒提取试剂盒：裂解方法一致。裂解完成后利用过滤柱纯化出质粒DNA质粒提取后，根据以后实验要求利用不同的限制性内切酶在水浴锅中进行酶切电泳，用凝胶成像系统分析测序第18页/共33页水稻基因组DNA的提取、

纯化和分析利用SDS法或Qiagen提供的基因组提取试剂盒提取水稻基因组DNA：利用SDS在高钾离子浓度的情况下能沉淀蛋白和多糖等杂质的原理提取基因组DNA利用酚-氯仿抽提或过滤柱纯化基因组DNA水稻基因组文库的构建利用特异的探针，通过Southernblotting检测目标基因的拷贝数第19页/共33页水稻各器官TotalRNA的提取、纯化和分析分离所需的水稻各器官组织，并利用Qiagen的RNeasy系列试剂盒提取总RNA：将材料裂解后，通过过滤柱纯化出总RNA在RNase-free的情况下，通过甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量利用特异性的探针，通过Northernblotting检测目标基因在各器官的表达情况第20页/共33页Southernblotting和NorthernblottingSouthernblotting基因组DNA完全消化探针制备琼脂水平电泳比活性测定印迹转膜DNA交联限制性内切酶、恒温水浴锅手提紫外灯、电泳仪器真空转膜仪紫外交联仪同位素检测仪探针制备试剂盒尼龙膜第21页/共33页Southernblotting和Northernblotting（续）制备好的尼龙膜探针（放射性或非放射性）杂交杂交箱放射自显影荧光同位素检测仪磷屏成像系统荧光扫描成像系统第22页/共33页克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析

克隆化基因的表达表达蛋白的纯化

功能分析第23页/共33页克隆化基因的表达基因的克隆：利用高保真的Taq酶和合适的反应系统，通过PCR获得与目标基因完全一致的DNA片段（通过测序确证）体内表达：选择合适的表达载体插入目标片段。利用化学方法或电转化仪等手段转入细胞表达体外转录和翻译系统：兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取物等第24页/共33页表达蛋白的纯化SDS聚丙烯酰胺胶回收：利用SDS聚丙烯酰胺胶分离不同大小的的蛋白。利用6×HIS、GST（谷胱甘肽）等和亲和树脂纯化：通过表达目标基因的融合蛋白，利用亲和层析洗脱出目标蛋白自动核酸/蛋白纯化工作站第25页/共33页目标蛋白功能分析抗体的制备：多抗、单抗DNA-蛋白质相互作用研究：Gel-shift实验、蛋白质磷酸化分析、酵母单杂交系统等蛋白质-蛋白质相互作用研究：酵母双杂交系统、噬菌体表面展示技术等第26页/共33页蛋白体内表达研究Westernblotting：利用抗原-抗体反应，对蛋白质混合物中的目标蛋白进行鉴别和定量免疫组织化学研究：通过切片技术和免疫反应，利用特异抗体检测特定蛋白在组织细胞内的表达和定位蛋白质芯片系统第27页/共33页基因转化实验和转基因结果分析转基因载体的构建：载体、农杆菌、特殊抗生素植株的转化：叶盘转化法、基因枪植株的筛选：荧光检测、GUS染色、PCR法基因功能分析：激光共聚焦显微镜、FISH等第28页/共33页部分分子生物学实验必需仪器

纯水仪移液器

pH计电子天平生化培养箱灭菌锅第29页/共33页谢谢第30页/共33页人有了知识，就会具备各种分析能力