微生物药物学第十章生物转化的类型和机制应用

微生物药物学第十章生物转化的类型和机制应用第一页，共六十一页，2022年，8月28日第一节生物转化的定义与研究内容

生物转化的含义更强调的是：用微生物或酶来进行药物合成（或其他有机合成）过程中的某一步或几步反应，而那些直接来源于微生物的代谢产物是微生物进行“从头到尾”的合成过程。

第二页，共六十一页，2022年，8月28日在许多国外文献中经常能够看到的描述这种技术的名词有：microbialtransformation;microbialconversion;BiotransformationBioconversionBiocatalysisenzymation等。

第三页，共六十一页，2022年，8月28日微生物(酶)转化是有机化学

反应中的一个特殊的分支。

微生物转化的本质是某种微生物将一种物质（底物）转化成为另一种物质（产物）的过程，这一过程是由某种微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂进行的一种或几种化学反应，简言之，即为一种利用微生物酶或微生物本身的合成技术。

第四页，共六十一页，2022年，8月28日

这些具有生物催化剂作用的酶大多数对其微生物的生命过程也是必需的，但在微生物转化过程中，这些酶仅作为生物催化剂用于化学反应。由于微生物产生的这些能够被用于化学反应的大多数生物催化剂不仅能够利用自身的底物及其类似物，且有时对外源添加的底物也具有同样的催化作用，即能催化非天然的反应（unnaturalreactions）。微生物(酶)转化是有机化学

反应中的一个特殊的分支。第五页，共六十一页，2022年，8月28日在研究一个微生物（或酶）转

化过程时，需要考虑的问题：所用转化底物的选择；所用微生物对不同底物转化能力的考察、转化路线或转化反应的选择等；其中最主要的是寻找适合于所设计转化过程的微生物，以及如何来提高这种微生物的转化能力，即提高这种酶活力；再则是发现一种新的酶或一种新的反应以便为设计一个新的微生物转化过程提供一条线索。第六页，共六十一页，2022年，8月28日用于转化的微生物或酶的多样性

用于微生物转化的菌株或酶的筛选的范围应该尽可能地广，因为至目前为止已经发现了3000余种能够催化各种化学反应的酶，其中有些酶的催化效果比化学催化剂好；另外，微生物的多样性和其生理生化特性的多样性（它们能够修饰和降解许许多多有机化合物），使我们有可能找到某种微生物或酶来催化某种特定的和所期望的化学反应。

第七页，共六十一页，2022年，8月28日第二节生物转化的基本类型

一、还原反应脱氢酶被广泛地用于醛和酮羰基以及烯烃碳-碳双键的还原，这种生物转化反应可使潜手性底物转化为手性产物。面包酵母醇脱氢酶和马肝醇脱氢酶能催化酮不对称还原，其还原产物仲醇的对映体过量率接近100%。第八页，共六十一页，2022年，8月28日

脱氢酶催化的还原反应第九页，共六十一页，2022年，8月28日二、氧化反应氧化反应是向有机化合物分子中引入功能基团的重要反应之一。生物催化的氧化反应主要由三大类酶：单加氧酶、双加氧酶和氧化酶，它们所催化的反应如下图所示：

第十页，共六十一页，2022年，8月28日生物催化的氧化反应类型

第十一页，共六十一页，2022年，8月28日单加氧酶和双加氧酶直接在底物分子中加氧，而氧化酶是催化底物脱氢，脱下的氢再与氧结合生成水或过氧化氢。脱氢酶与氧化酶相似，也是催化底物脱氢，但它催化脱下的氢与氧化态NAD(P)+结合，而不是与氧结合，这是两者的主要区别。氧化反应表面上看是加氧或脱氢，其本质是电子的得失。单加氧酶、双加氧酶和氧化酶是催化底物氧化失去电子，并将电子交给氧，即氧是电子受体；脱氢酶催化底物失去电子，它将电子交给NAD(P)+，然后还原型NAD(P)H再通过呼吸链或NAD(P)H氧化酶将电子最终交给氧并生成水。氧化反应类型：第十二页，共六十一页，2022年，8月28日三、水解反应

水解酶（hydrolases，）是最常用的生物催化剂，占生物催化反应用酶的65%左右。它们能够水解酯、酰胺、蛋白质、核酸、多糖、环氧化物和腈等化合物，这些反应的形式如图所示。

其中酯酶、脂肪酶和蛋白酶是生物催化手性合成中最常用的水解酶。第十三页，共六十一页，2022年，8月28日生物催化的水解反应的类型第十四页，共六十一页，2022年，8月28日工业上常用的酰胺水解酶有：酰胺酶（amidase）又称氨基肽酶，其能催化消旋体氨基酸酰胺选择性水解生成L-氨基酸；氨基酰化酶（acylase），其能选择性地催化L-N-酰基氨基酸水解，如这类酶能够催化消旋体N-乙酰色氨酸和N-乙酰苯丙氨酸水解拆分制备L-苯丙氨酸和L-色氨酸；乙内酰脲酶俗称海因酶，这类酶在体内负责催化嘧啶碱基代谢中二氢嘧啶环的水解开环反应，故又称二氢嘧啶酶，常用的海因酶与酰胺酶和酰化酶不同，它优先水解D-型对映体，属D-海因酶；内酰胺酶，其可用于消旋体内酰胺的水解拆分，这些单一对映体的产物是合成很多生理活性物质的重要中间体。

第十五页，共六十一页，2022年，8月28日四、转移和裂合反应在生物催化中最为常用的酶为氧化还原酶和水解酶，其在催化手性合成反应中约占90%左右。然而，其他四大类酶--转移酶、裂合酶、异构酶和连接酶（合成酶）在生物催化中也有着重要的应用，它们能催化C—C、C—N、C—O以及C==C和C==O等化学键的生成或裂解反应。第十六页，共六十一页，2022年，8月28日第三节生物转化与手性药物合成

生物催化剂为高度手性催化剂，催化反应效率高、立体选择性好，反应产物对映体过量率（e.e）有时可达100%，生物催化法是实现手性合成的有效途径，而很多药物的药理活性与毒性与药物手征性结构密切相关。

第十七页，共六十一页，2022年，8月28日利用生物转化技术制备手性药物（关键中间体）的一些实例

酶关键中间体制药工业实例脂肪酶抗抑郁药帕罗西汀，脂肪酶拆分得到(S)--甲基--乙酰硫代丙酸抗高血压药卡托普利氧化酶选择性氧化得到(R)--甲基--羟基丙酸脂肪酶拆分得到(2R,3S)-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯抗心绞痛和高血压药地尔硫卓脂肪酶拆分得到手性侧链-氨基-N-苯甲酰基-(2R,3S)-3-苯基异丝氨酸抗肿瘤药紫杉醇脂肪酶拆分消旋体非甾体消炎药（S）-奈普生脂肪酶拆分消旋体非甾体抗炎药（R）-氟比洛芬脂肪酶拆分得到D-泛酸内酯辅助药D-泛酸第十八页，共六十一页，2022年，8月28日单加氧酶（R）-3-（对氯苯基）-4-丁内酯解痉药(R)-（-）-巴氯酚-胰凝乳蛋白酶拆分得到（R）-3-(对氯苯基)戊二酸甲酯单加氧酶（S）-(+)-ε-内酯维生素类药（R）硫辛酸单加氧酶甾体单加氧酶不对称醇类的酶法拆分β-受体阻滞药美托洛尔、阿替洛尔单加氧酶β-受体阻滞药阿替洛尔单加氧酶β-受体阻滞药普瑞特罗（prenalterol）单加氧酶磷霉素利用生物转化技术制备手性药物（关键中间体）的一些实例

第十九页，共六十一页，2022年，8月28日一、有关手性合成的几个基本概念

1、手性或手征性（chiral或chirality）

所谓手征性是指实物与其镜像不能相互重合的性质，如同人的左手和右手的关系，互为镜像，但不能重合。判断分子是否具有手征性，必须考虑它缺少哪些对称因素。通常只要一个分子既没有对称面又没有对称中心时，就可以断定它是手征性分子。造成分子有手征性的一个最通常的因素是含有手性碳原子（常用*C表示），即和四个不同原子或基团相连的碳原子。第二十页，共六十一页，2022年，8月28日

2、手性药物（chiraldrug）

所谓手性药物是指单一异构体药物。

近年来人们对手性药物愈来愈关注的重要原因是它们的治疗活性主要存在于一种异构体，而另一（些）异构体或是无活性的、或是具有不同的药理活性，甚至有严重的毒副作用。第二十一页，共六十一页，2022年，8月28日3、对映体、对映异构体（enantiomer）

具有一定构造的分子，其原子在空间的排列方式可能不止一种，即可能存在不止一种构型。凡是手性分子，必有互为镜像的构型。这种互为镜像的两种构型叫做对映体。分子的手性是对映体存在的必要和充分的条件。一对对映体的构造相同，只是立体结构不同，因此它们是立体异构体。这种立体异构体就叫做对映异构体。第二十二页，共六十一页，2022年，8月28日3、对映体、对映异构体（enantiomer）对映异构和顺反异构一样都是构型异构。要把一种异构体变成构型异构体，必须断裂分子中的两个键，然后对换两个基团的空间位置。而构象异构则不同，只要通过键的扭转，一种构象异构体就可以转变为另一种构象异构体。第二十三页，共六十一页，2022年，8月28日4、立体异构体（stereoisomer）其分子由相同数目和相同类型的原子组成，是具有相同的连接方式但原子的空间排列方式不同，即构型不同的化合物。第二十四页，共六十一页，2022年，8月28日5、非对映异构体（diastereoisomer）具有二个或多个非对称中心，且其分子相互不为镜像的立体异构体。如D-赤鲜糖和D-苏糖常简称为“非对映体”。第二十五页，共六十一页，2022年，8月28日6、不对称合成、手性合成（asymmetricsynthesis,chiralsynthesis）

不对称合成常常也被称之为手性合成。最初的定义为，不对称合成是一个用纯手性试剂通过非手性底物的反应形成光学活性化合物（opticallyactivecompound）的过程，即从一个具有对称构造的化合物产生光学活性物质的反应过程。

第二十六页，共六十一页，2022年，8月28日6、不对称合成、手性合成（asymmetricsynthesis,chiralsynthesis）更为广义的不对称合成的定义为，一个反应，其中底物分子整体中的非手性单元由反应剂以不等量地生成立体异构产物的途径转化为手性单元。也就是说，不对称合成是一个过程，它将潜手性（prochiral）单元转化为手性单元，使得产生不等量的立体异构产物。

第二十七页，共六十一页，2022年，8月28日一个成功的不对称反应的标准1）高的对映体过量（e.e）；2）用于不对称反应的反应剂应易于制备并能循环使用；3）可以制备得到R和S两种构型；4）最好是催化性的合成。

迄今，能完成最好的不对称合成的反应剂可以认为是生物催化剂，即自然界中的微生物和酶。第二十八页，共六十一页，2022年，8月28日7、不对称放大、手性合成子和手性助剂（asymmetricamplification,chiralsynthon,chiralauxiliary）不对称放大是指应用一种具较低对映体纯度的催化剂或试剂制备具较高对映体纯度的产物的过程。手性合成子为一单对映体化合物，以其作为起始原料在反应过程中诱导产生所需的手性化合物。手性助剂为一单对映体化合物，其通过共价键与底物暂时结合，在反应过程中诱导出手性，最后再使共价键断开得到单对映体产物，并回收助剂。第二十九页，共六十一页，2022年，8月28日8、外消旋、内消旋和外消旋化

（racemic,meso,racemization）外消旋是指一种物质以两种互为对映体的手性分子的等量混合物形式存在的现象，这种物质即为外消旋体。外消旋体也称为外消旋混合物（racemicmixture）或外消旋物(racemate)，其化合物名称前用dl（不鼓励使用）或符号（较好）或用前缀rac表示。第三十页，共六十一页，2022年，8月28日8、外消旋、内消旋和外消旋化

（racemic,meso,racemization）内消旋是指一种物质的分子内具有2个或多个非对称中心但又有对称面，因而不能以对映体存在的现象，这种物质即为内消旋体，其化合物用前缀meso表示。外消旋化是指一种对映体转化为两个对映体的等量化合物。内消旋体和外消旋体都没有旋光性，但它们在本质上是不同的。第三十一页，共六十一页，2022年，8月28日9、光学（旋光）活性、光学（旋光）异构体和光学纯度（opticallyactive,opticalisomer,opticalpurity）光学活性是指由实验观察到的一种物质将单色平面偏振光的平面向观察者的右边或左边旋转的性质，通常用（+）表示右旋，用（–）表示左旋。光学异构体即为对映体的同义词，现已不常用，因为一些对映体在某些光波长下并无光学活性。光学纯度是指根据实验测定的旋光度，在两个对映混合物中一个对映体所占的百分数。

第三十二页，共六十一页，2022年，8月28日10、立体选择性反应和立体专一性反应

（stereoselectivereaction,stereospeceficreaction）

如果一个反应不管反应物的立体化学如何，生成的产物只有一种立体异构体（或有两种立体异构体时，其中一种异构体占压倒优势），这样的反应被称之为立体选择性反应。从立体化学上有差别的反应物给出立体化学上有差别的产物的反应被称之为立体专一性反应。所有的立体专一性反应必定是立体选择性反应，但不是所有的立体选择性反应必定是立体专一性反应，因为有些反应物是没有立体结构特征，而生成物是有立体结构特征的。

第三十三页，共六十一页，2022年，8月28日11、对映体过量（enantiomericexcess,简称e.e）和对映选择性（enantioselectivity）

对映体过量（e.e）是指在两个对映体混合物中，一个对映体E1过量的百分数，即

e.e=[（E1–E2）]/[（E1+E2）]×100%

对映选择性是指一个化学反应（包括生物反应等）产生一种对映体多于相对对映体的程度。

第三十四页，共六十一页，2022年，8月28日12、D/L、R/S和d/l

D/L为分子的绝对构型，按照与参照化合物D-或L-甘油醛的绝对构型的实验化学关联而指定。D/L标记法应用已久，也比较方便。但是这种标记只能表示出分子中一个手性碳原子的构型，对于含有多个手性碳原子的化合物不合适，有时甚至会产生名称上的混乱。因此，其仅常用于一些常见的和天然的氨基酸或糖，对其它一些化合物目前都采用R/S来表示。第三十五页，共六十一页，2022年，8月28日12、D/L、R/S和d/lR/S标记法是根据手性碳原子所连接的四个基团的排列顺序来标记手性碳原子构型的一种方法。因此，在化学反应中，如果手性碳原子构型保持不变，产物的构型与反应物的相同，但其“R”或“S”标记却不一定与反应物相同。反之，如果反应后手性碳原子的构型转化了，产物构型的“R”或“S”也不一定与反应物相同。因为经过化学反应，产物的手性碳上所连接的基团与反应物的不一样了，产物和反应物的相应基团的排列次序可能相同也可能不同。“R”或“S”的标记，决定于它本身四个基团的排列次序，而与反应时的构型是否保持不变无关。第三十六页，共六十一页，2022年，8月28日12、D/L、R/S和d/ld或l是指物质右旋或左旋，是按照实验测定的将单色平面偏振光的平面向右或向左旋转而定，目前常用（+）表示右旋，用（–）表示左旋。

第三十七页，共六十一页，2022年，8月28日13、拆分（resolution）拆分是指将外消旋体分离成旋光体的过程。外消旋体是有一对对映体等量混合而成。对映体除旋光方向相反外，其它物理性质都相同，因此，虽然外消旋体为两种化合物的混合物，但用一般的物理方法，如蒸馏、重结晶等不能把一对对映体分离开来，必须用特殊的方法才能把它们拆开。目前常用的一些方法包括有以下几种。第三十八页，共六十一页，2022年，8月28日化学拆分法：这个方法应用最广。其原理是将对映体转变为非对映体，然后分离。外消旋体与无旋光性的物质作用并结合后，仍是外消旋体。但是若使外消旋体与旋光性物质作用并结合后，则原来的一对对映体变成了两种互不对映的衍生物。于是外消旋体变成了非对映体的化合物。非对映体具有不同的物理性质，可以用一般的分离方法把它们分开。最后再把分离所得的两种衍生物分别变回原来的旋光物质，即达到了拆分的目的。这种拆分法最适合于酸或碱的外消旋体的拆分。目前已经开发了许多光学异构体分离用的介质。第三十九页，共六十一页，2022年，8月28日生物拆分法：某些微生物或它们所产生的酶。对于对映体中的一种异构体有选择性的分解作用。利用微生物或酶的这种性质可以从外消旋体中把一种旋光体拆分出来，但在拆分过程中，外消旋体至少有一半被消耗掉了。第四十页，共六十一页，2022年，8月28日诱导结晶拆分法：

在外消旋体的过饱和溶液中，假如一定量的一种旋光体的纯晶体作为晶种。由于溶液中这种旋光体的含量较高，且在晶种的诱导下优先结晶析出。将这种结晶滤出后，则另一种旋光体在滤液中相对较多。再加入外消旋体制成过饱和溶液，于是另一种旋光体优先结晶析出。如此反复进行结晶，就可以把一对对映体完全分开。第四十一页，共六十一页，2022年，8月28日选择吸附拆分法：

用某种旋光物质作为吸附剂，使之选择性地吸附外消旋体中的一种异构体，以达到拆分的目的。近年来开发用于分离光学异构体的拟移动床色谱就是根据这种原理设计的。第四十二页，共六十一页，2022年，8月28日逆流萃取拆分法：

在萃取液中使用合适的手性助剂，以逆流萃取的方法可以使外消旋体混合物对映体得到分离。第四十三页，共六十一页，2022年，8月28日14、外消旋体转换（racemicswitch）即从已知的外消旋体药物开发单一异构体药物。这对该品种的原开发商而言可籍此延长产品的专利保护期。对其它厂商而言是一条获得新产品的捷径，因为其相对风险小投入少。第四十四页，共六十一页，2022年，8月28日

美国FDA于1992年公布了手性药物指导原则称：制药厂商必须确定外消旋体及各立体异构体的特性、作用效果、质量、纯度，比较各异构体的体外系统和（或）人体中的药理活性，如异构体之间药物动力学特性有差异的需分别测定相关的数据。

二、开发手性药物的意义第四十五页，共六十一页，2022年，8月28日另外，鼓励开发已经上市的外消旋体药物的单一异构体，即如果发现单一异构体的疗效提高、副作用减轻或具有新的药理作用，就可以扩大适应症范围，并可望延长专利保护期。FDA还正在考虑给此类单一异构体部分以新化学实体的待遇，享受一定期限的市场独占权。二、开发手性药物的意义第四十六页，共六十一页，2022年，8月28日

市售的单一异构体和外消旋体药物

世界市售药物制备方法手征性销售形式总数非手性手性单一异构体外消旋体原料药总数（1850）生物或半合成52365175098全合成132779952861467第四十七页，共六十一页，2022年，8月28日

药物的手征性问题在制药工业界愈来愈受到重视。对单一异构体药物，即俗称为手性药物的关注有许多理由。最重要的一点是药物的作用靶点---生物体的酶和细胞表面受体是手性的。外消旋体药物的两个对映体在体内以不同的途径被吸收、活化或降解后，就与具有不同手征性特性的靶点结合，从而出现这两种对应体可能有相同的药理活性，或者是一种可能是活性的，另一种可能是无活性的甚至是有毒性的，或者是两者可能有不同程度或不同性质的活性。

二、开发手性药物的意义第四十八页，共六十一页，2022年，8月28日在生物体系中，立体异构识别是很明显的。一般就手性化合物而言，可能有四种不同的生物学效应：只有一种异构体具有所希望的生物活性，而另一种没有显著的所希望的生物活性。只有一种异构体具有所希望的生物活性，而另一种不具有所希望的生物活性。只有一种异构体具有所希望的生物活性，而另一种具有不希望的生物活性。两种异构体具有不同药理作用的生物活性。二、开发手性药物的意义第四十九页，共六十一页，2022年，8月28日三生物转化与手性中间体的制备

手性药物制备的关键技术是不对称合成(asymmetricsynthesis)技术。多年来，有机化学工作者已经研究开发了许多种用化学的方法进行不对称合成的技术，但近20多年来，很多长期从事化学合成研究的工作者对微生物和酶反应发生了兴趣，与此同时，很多长期从事微生物和酶的研究的工作者对如何将此应用于有机合成发生了兴趣，从而使生物催化转化（biocatalytictransformation）成为一种进行不对称合成的重要技术。第五十页，共六十一页，2022年，8月28日应用生物催化转化技术进行不对称合成与

化学合成法相比较具有的优越性有：1）转化底物某一基团的专一性强，即对不需要转化的基团无需保护；2）通过对用于某一转化的微生物进行菌种选育和转化条件的优化，可以得到极高的转化率；3）生物催化转化的反应条件温和且对环境的污染很小。特别是近年来DNA重组技术的应用和新的转化系统的开发应用，使愈来愈多的原来使用化学方法进行不对称合成的化合物有可能被生物催化转化的方法来替代。

第五十一页，共六十一页，2022年，8月28日第三节

参与药物制备过程重要反应的酶类及作用机制

已经研究和应用了各种各样的微生物来源酶于有关药物制备和其他精细化学品的制备，特别是在消旋体的拆分、不对称合成，以及其他复杂化学反应中的应用。尽管经典的化学反应都能够实现这些过程，但用于酶催化反应的微生物资源的可再生性、反应过程的环境友好性，以及其他化学反应无法比拟的优越性，愈来愈多化学反应将被酶促反应所取代。这些酶类参与的反应涉及到如下几个方面:第五十二页，共六十一页，2022年，8月28日1、生物催化拆分生物催化拆分（biocatalyticresolutions），即为利用酶对对映异构体中的一种手性分子具有特异性的催化作用，而对对映异构体中的另一种手性分子不起作用这样的特性，将具有催化特异性的一种对映异构体转化为所希望的对映体纯的产物/中间体。至今为止，在生物催化拆分中使用最多的是水解酶。第五十三页，共六十一页，2022年，8月28日1、生物催化拆分从经济的角度看，利用水解酶进行拆分是不合算的，因为从理论上讲，其最高得率仅为50％。这一不足从理论上讲，通过有效地结合外消旋化可以来弥补。这种通过外消旋化来得到单一对映体的方法，即为动态动力学拆分（dynamickineticresolution）。外消旋化可以自发进行，如乙内酰脲；也可以通过改变反应条件，如pH和温度；或者通过使用外消旋酶来进行。

第五十四页，共六十一页，2022年，8月28日2、对映体会聚转化另外一条能够得到100%对映体转化收率的不同路线是对映体会聚转化（enantioconvergenttransformations），即：利用两种对映体互补的酶进行不同区域特异性的转化，或是结合使用酶催化和化学催化的方法，使得到100%的转化收率。前一种方法的适用范围不广，后一种方法已经在（R）-Nifenalol（硝苯洛尔）的制备过程中获得了成功，其利用