微生物培养筛选与保存

微生物培养筛选与保存第一页，共六十页，2022年，8月28日1.微生物菌种的保藏为什么要进行菌种保藏菌种保藏的目的菌种保藏的原理菌种保藏的方法2第二页，共六十页，2022年，8月28日

斜面低温保藏法石蜡油封藏法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法第三页，共六十页，2022年，8月28日2、菌种的复壮

狭义的复壮－－消极的措施指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。

广义的复壮－－积极的措施指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。第四页，共六十页，2022年，8月28日菌种复壮的主要方法1、纯种分离法

菌落纯（“菌种纯”）细胞纯（“菌株纯”）

通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。平板表面涂布法平板划线分离法琼脂培养基浇注法用分离小室进行单细胞分离用显微操作器进行单细胞分离菌丝尖端切割进行单细胞分离第五页，共六十页，2022年，8月28日二、生长曲线的测定第六页，共六十页，2022年，8月28日任务一：认识生长曲线的概念任务二：为生长曲线的绘制设计实验方案7第七页，共六十页，2022年，8月28日任务一：什么是生长曲线第八页，共六十页，2022年，8月28日什么是微生物的生长曲线将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。9第九页，共六十页，2022年，8月28日10第十页，共六十页，2022年，8月28日

将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。11第十一页，共六十页，2022年，8月28日12第十二页，共六十页，2022年，8月28日哪些情况下需要测定微生物的生长曲线？1.工业发酵中往往要接入处于对数期(特别是中期)的菌体，以尽量缩短停滞期。2.分子生物学实验中，选择对数期的菌体，制备感受态细胞，进行基因工程实验13第十三页，共六十页，2022年，8月28日任务二：设计实验方案第十四页，共六十页，2022年，8月28日1.任选大肠杆菌或酵母菌2.结合实验室实际情况，设计实验方案，要求包括：（1）实验原理（2）材料与方法（3）预期结果15第十五页，共六十页，2022年，8月28日接下来请大家汇报实验方案第十六页，共六十页，2022年，8月28日本次的作业：请大家设计实验方案，要求包括：（1）实验原理（2）材料与方法（3）预期结果A4纸打印上交第十七页，共六十页，2022年，8月28日四、食品微生物检测第十八页，共六十页，2022年，8月28日一、食品微生物的检验流程二、食品微生物样品采集与制备三、食品微生物检验1.食品中菌落总数检测2.食品中霉菌和酵母菌检测四、制定实验方案19第十九页，共六十页，2022年，8月28日食品检验的目的1.便于食品卫生质量监督管理；2.鉴别食品中是否存在有毒有害物质3.为新产品、新资源利用、新食品等进行卫生鉴定第二十页，共六十页，2022年，8月28日一.食品微生物检验的一般步骤样品采集样品处理样品保存选择参考菌群检验前的准备菌落总数大肠菌群致病菌分离培养分离培养增菌纯化染色镜检生化试验血清学试验动物试验结果报告第二十一页，共六十页，2022年，8月28日二、食品微生物样品采集与制备取样：代表性微生物检验的取样过程中，避免操作引起污染。一个无菌样品的采集，应该通过这样一种方式，即：在收集过程中，本身应避免污染，然后放入消毒容器中。22第二十二页，共六十页，2022年，8月28日（一）

检验前的准备准备好所需的各种仪器，如冰箱、水浴锅、培养箱等。按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。准备好所用的各种试剂，制备营养琼脂或其他培养基。做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前灭菌30~50min.准备好采样必需的工具和器材，如剪刀、镊子、勺子等。采样后样品运输、保存相关准备。第二十三页，共六十页，2022年，8月28日（二）样品的采集第二十四页，共六十页，2022年，8月28日采样的步骤采样前调查→现场观察→确定采样方案→采样→样品封存→开具采样证明第二十五页，共六十页，2022年，8月28日采样的原则1、根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案2、应采用随机原则，确保所采样品必须具有代表性。3、采样操作必须遵循无菌原则，要防止污染，防止变质、损坏、丢失。严格遵守样品采集的操作规程。4、样品在保存和运输过程中，应采取措施防止样品中原有微生物数量的变化，不得加入防腐剂、固定剂等。5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加。第二十六页，共六十页，2022年，8月28日食品微生物检验的采样方案微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分析的样品的代表性至关重要，也即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。要保证样品的代表性首先要有一套科学的抽样方案，其次使用正确的抽样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。目前最为流行的抽样方案为ICMSF推荐的抽样方案和随机抽样方案。无论采取何种方法抽样，每批货物的抽样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品，抽样数量应适当增加，最低不少于8件。第二十七页，共六十页，2022年，8月28日样品的种类大样，就是一整批；中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般每批抽样数量不少于5件，一般为200g；小样，也称检样，直接进行分析用的，一般为25g。第二十八页，共六十页，2022年，8月28日食品微生物检验的采样方案ICMSF取样方案；美国FDA的取样方案；世界粮农组织（FAO）取样方案；我国的食品取样方案。ICMSF(TheIntermationalCommitteeonMicrobiologicalSpecificationforFood)国际食品微生物标准委员会第二十九页，共六十页，2022年，8月28日食品微生物检验采样方法采样原则：

能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取样.第三十页，共六十页，2022年，8月28日1、液体样品采样方法

充分混匀后，无菌操作打开包装，用100mL无菌注射器抽取,注入无菌盛样容器.第三十一页，共六十页，2022年，8月28日2、半固体样品采样方法无菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。

第三十二页，共六十页，2022年，8月28日3、固体样品采样方法大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。

第三十三页，共六十页，2022年，8月28日4、冷冻食品采样方法大包装小块冷冻食品按小块个体采取；大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。若为检验食品污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质情况，应从深部取样。第三十四页，共六十页，2022年，8月28日5、生产工序监测采样车间用水：从车间各龙头采样；车间台面、用具、及加工售货员手的卫生监测：用5cm2孔无菌采样板和5支无菌棉签擦拭25cm2面积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容器中。第三十五页，共六十页，2022年，8月28日车间空气采样：将5个直径90mm的普通琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖盖送检。平皿第三十六页，共六十页，2022年，8月28日（七）采样标签的填写标签内容主要：

编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。第三十七页，共六十页，2022年，8月28日×××××采样单样品编号：━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━产品名称（商品名）______规格型号__________注册商标_____________生产厂家_______________通讯地址__________邮政编码□□□□□□受检地点_______________通讯地址__________邮政编码□□□□□□采样地点_______________采样日期__________采样基数______________生产日期_______________批号__________产品依据标准__________有效成分及含量____________________________________________________________检验目地________________检测项目_____________________________

采样人仔细阅读以下句子，然后签字我认真负责地填写了该样品采样单，承认以上填写的合法性，被该采亲单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和公正性。代表单位（章）代表单位（章）签字签字日期年月日日期年月日

备注

第三十八页，共六十页，2022年，8月28日四.样品的送检要求1、要快速运送：不要超过3小时；2、若路途遥远，可在1~5℃低温下运送；3、要注意防污染、防散漏、防变质；4、要填写检验申请单。第三十九页，共六十页，2022年，8月28日五.样品的处理方法（一）液体样品（二）固体样品（三）冷冻样品第四十页，共六十页，2022年，8月28日（一）液体样品的处理瓶装液体样品的处理盒装或软塑料包装样品的处理第四十一页，共六十页，2022年，8月28日1.瓶装液体样品的处理

用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25mL检验。第四十二页，共六十页，2022年，8月28日2.盒装或软塑料包装样品的处理

将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。第四十三页，共六十页，2022年，8月28日（二）固体样品的处理捣碎均质法剪碎振摇法研磨法整粒振摇法胃蠕动均质法第四十四页，共六十页，2022年，8月28日1.捣碎均质法将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，8000~10000r/min均质1~2min即可。第四十五页，共六十页，2022年，8月28日视频：无菌均质器第四十六页，共六十页，2022年，8月28日2.剪碎振摇法将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。第四十七页，共六十页，2022年，8月28日3.研磨法

将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。第四十八页，共六十页，2022年，8月28日4.整粒振摇法直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。第四十九页，共六十页，2022年，8月28日（三）冷冻样品冷冻样品，先将中样在0~4℃下解冻，时间不能超过18h，或在45℃下解冻，时间不能超过15min。再取检样25g做稀释处理。第五十页，共六十页，2022年，8月28日请大家参考p229附录五中国食品微生物限量规定列出的食品，选择一种制定样品的采集与制备方案，包括：1）选择何种食品2）用品准备3）样品采集具体操作步骤4）样品处理具体操作步骤第五十一页，共六十页，2022年，8月28日作业要求：提交一篇小论文：XX菌落总数的检测报