微生物工程重点内容课件

微生物工程的基本概念

的特定性状和机能，通过现代化工程技术，生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系；是将传统发酵与现代基因工程、细胞工程、代谢工程、生物信息工程和计算机控制等新技术结合并迅速发展起来的现代发酵技术。微生物工程是渗透有工程学的微生物学，是发酵技术工程化的发展。微生物工程发展简史1、传统的微生物发酵技术——天然发酵2、第一代微生物发酵技术——纯培养技术3、第二代微生物发酵技术——深层培养技术4、第三代微生物发酵技术——代谢调控技术5、第四代发酵技术——基因工程技术微生物工程

微生物工程既基于生物学知识、又依托工程概念，解决的是生物技术产业化进程中的关键问题，被誉为工业生物技术的核心。借助于微生物进行产品开发或环境改造是微生物工程的基本内容和目标，涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题，为人类社会带来巨大经济和社会效益。菌种的选育培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种发酵过程产品的分离提纯等微生物发酵生产流程微生物工程产品类型1.微生物代谢产物发酵2、微生物菌体的发酵3、微生物的生物转化初级代谢产物与菌体生长相伴随的产物，氨基酸、核苷酸、维生素、有机酸、溶剂菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累次级代谢产物与菌体生长不相伴随，以初级代谢产物为原料而合成

抗生素、生物碱、毒素、胞外多糖等

结构常较复杂对环境条件敏感1.微生物代谢产物发酵发酵生产产品的类型目的次级代谢产物

secondarymetabolite

是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同种类的微生物所产生的次级代谢产物不相同，他们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。2、微生物菌体的发酵SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）生物防治制剂（如苏云金杆菌）活性乳酸菌制剂、食用和药用酵母细胞的生长与产物的积累成平行关系，生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段3、微生物的生物转化

利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链等。

转化的最终产物并不是微生物细胞利用营养物质经细胞代谢产生，而是微生物细胞的酶或酶系作用于底物的某一部位，进行特定部位的化学反应而形成。

反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、结构位置特异性、立体特异性工业微生物的特点1、概念(什么是工业微生物)

从来源于自然界大量的微生物中分离并筛选出有用菌种，再加以改良，贮存待用于生产的微生物称为工业微生物。通常在发酵过程作为活细胞催化剂

传统的工业微生物包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。目前最有应用前景的工业微生物：基因工程菌株2、工业微生物种类2.1原核细胞类微生物:细菌、放线菌、立克次氏体、衣原体等2.2真核细胞类微生物:酵母菌和霉菌，单细胞藻类、原生动物等2.1非细胞类微生物（主要作为基因工程的载体）:RNA病毒（逆转录病毒）DNA病毒（腺病毒）3、微生物的特点3.1种类多3.2分布广3.3体积小3.4繁殖快3.5代谢强3.6易变异（1）廉价原料、生长迅速、目的产物产量高。（2）易于控制培养条件，生产效率高。发酵周期较短。（3）抗杂菌和噬菌体的能力强。（4）菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。（5）产品容易分离提纯。对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶；对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎。二、工业化菌种的要求基因工程菌与传统工业微生物的差别前者含有带外源基因的重组载体;而后者是单一的微生物细胞;前者需要发酵条件满足外源基因的表达，后者则只需要满足细菌本身的生长和代谢需要要获得高水平的产品，基因工程菌生产过程中往往使用高密度发酵基因工程菌发酵问题中最重要的两个问题是菌体的高密度发酵和诱导条件的确定。

培养基的主要成分及作用

一、碳源主要功能：1）为菌体的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的成分；2）为合成目的产物提供所需的碳素成分常用的碳源:特殊情况下（如碳源贫乏时），蛋白质水解物或氨基酸等也可被微生物作为碳源使用。糖类发酵培养基中使用最广泛的碳源;主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等油脂这些微生物都具有比较活跃的脂肪酶，在脂肪酶的作用下，油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，进一步氧化成CO2和H2O，并释放出大量的能量。当微生物利用脂肪作为碳源时，要供给比糖代谢更多的氧，不然大量的脂肪酸和代谢中的有机酸会积累，从而引起pH的下降，并影响微生物酶系统的作用。常用豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等有机酸一些微生物对多种有机酸（如乳酸、柠檬酸、乙酸等）有很强的氧化能力，可以有机酸或有机酸盐作为碳源。有机酸的利用常会使pH上升，尤其是有机酸盐氧化时，常伴随着碱性物质的产生，使pH进一步上升。低碳醇等三、无机盐和微量元素◆磷酸盐：磷是某些蛋白质和核酸的组成成分磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用微生物对磷的需要量一般为0.005～0.01mol/L常用K3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4◆钾盐：钾不参与细胞结构物质的组成是许多酶的激活剂菌体生长所需钾量约为0.1g/L(以K2SO4计)◆微量元素：需量微少，但又不可缺少一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中，本身含有，不必另加某些金属离子，特别是汞离子和铜离子，具有明显的毒性硫酸镁：Mg2+是许多重要酶（如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂镁离子能提高一些氨基糖苷类抗生素产生菌对自身所产的抗生素的耐受能力，如卡那霉素、链霉素、新生霉素等产生菌。

硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分硫是构成一些酶的活性基硫酸镁加入培养基中，在碱性条件下会形成氢氧化镁沉淀，配料时要注意。四、生长因子概念：微生物生长不可缺少的微量有机物质。类别：维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍物提供生长因子的农副产品原料1）玉米浆

用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩液，也是玉米淀粉生产的副产品

虽然主要用作氮源，但它含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，常用作为提供生长因子的物质。2）麸皮水解液：

可代替玉米浆，蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。

用量一般为1%（以干麸皮计）左右3）糖蜜

甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米浆，但氨基酸等有机氮含量较低

甘蔗糖蜜用量为0.1%～0.4%4)酵母：

酵母膏、酵母浸出液、酵母粉5）其他：

牛肉膏、蛋白胨、动物心、肝等组织浸液等都含有丰富的生长因子1、培养基分类：按培养基成分1）合成培养基：所用原料的化学成分明确、稳定如葡萄糖、硫酸铵适于研究菌种基本代谢和过程的物质变化等科研工作；在生产某些疫苗的过程中，为了防止异性蛋白质等杂质掺入，也常用合成培养基；营养单一、价格较高，不适于大规模生产2）天然培养基：原料是一些天然动、植物产品如花生饼粉、蛋白胨等来源广泛（大多为农副产品）、营养丰富、价格低廉、适于工业化生产一般不需要另加微量元素、维生素等物质由于成分复杂，不易重复，如对原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性3.半合成（组合）培养基：

在合成培养基的基础上添加些天然成份，以更有效地满足微生物对营养物的需要如马铃薯-蔗糖培养基3、根据培养基用途来分基础培养基富集培养基选择培养基鉴别培养基按生产工艺来分孢子培养基种子培养基发酵培养基小结培养基的类型

分类依据类型

营养物质来源天然、合成、半合成

培养基物理状态液体、固体、半液体

培养基的成分和目的基本、完全、鉴别、选择

生产工艺的要求孢子(Spore)、种子、发酵培养基的用途：

筛选菌种、保藏菌种、检验杂菌、培养种子、

发酵生产等巴斯德效应Pasteureffect

1861年巴斯德(L.Pasteur)在研究酵母的酒精发酵量和氧分压之间的关系中发现在厌氧条件下,向高速发酵的培养基中通入氧气,则葡萄糖消耗减少,抑制发酵产物积累的现象称为巴斯德效应。即呼吸抑制发酵的作用。

在好氧条件下，酵母发酵能力下降。磷酸果糖激酶，是变构酶，受ATP，柠檬酸及其他高能化合物抑制，被AMP,ADP激活；在好气条件下，糖代谢进入TCA，产生柠檬酸并通过氧化磷酸化生成大ATP，细胞内柠檬酸生成增加，反馈抑制磷酸果糖激酶的合成，阻遏作用由于ATP反馈抑制此酶的活性而加强；由于磷酸果糖激酶受抑制，导致6-磷酸果糖积累，当反应6-磷酸葡萄糖≒6-磷酸果糖达到平衡，醛糖和酮糖的摩尔比=7:3，导致6-磷酸葡萄糖积累，反馈抑制己糖激酶，抑制葡萄糖进入细胞内，导致葡萄糖利用率降低；好气条件下丙酮酸激酶的活性降低，此酶受磷酸果糖激酶催化生成的1,6-二磷酸果糖的激活，丙酮酸激酶活性降低，导致磷酸烯醇丙酮酸积累，反馈抑制己糖激酶；在厌氧发酵过程中，丙酮酸在不同的受氢体的作用下产物会不同，也就是说在不同酶的催化下会获得不同的产物，都有哪些酶和哪些产物？

乳酸脱氢酶----乳酸丙酮酸脱羧酶------乙醛-----乙醇脱氢酶-----乙醇丙酮酸脱氢酶----乙酰CoA---------丁酰CoA丁醛-----丁醇丙酮什么是好氧发酵和厌氧发酵，其主要代表产品有哪些好氧发酵：发酵时需要氧的参与，而且在氧气充足的条件下发酵效率更高代表产品：链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素厌氧发酵：发酵时不需要氧的参与，氧气可能会对发酵产生不良影响代表产品：酒精、丙酮、丁醇、甘油A.亚硫酸盐法甘油发酵（酵母第二型发酵）C6H12O6+NaSHO3→2CH2OHCHOHCH2OH+CH3CHOHOSO2Na+CO2在酵母中，乙醇脱氢酶活力很强，在该酶的作用下，乙醛作为受氢体而被还原成乙醇，因此，在乙醇发酵中，甘油生成量很少。如果改变发酵条件或者加入某种抑制剂，阻止乙醛作为受氢体，就可以积累大量甘油，如在发酵醪中加入亚硫酸氢钠，与乙醛起加成反应生成难溶的乙醛亚硫酸氢钠加成物。这样乙醛不能作为受氢体，必须有磷酸二羟丙酮作为受氢体，生成大量甘油，即转为甘油发酵，也叫做酵母第二型发酵。B.碱法甘油发酵(酵母第三型发酵)2C6H12O6+H2O→2CH2OHCHOHCH2OH+C2H5OH+CH3COOH+2CO2当酵母在碱性（PH7.6）条件下进行发酵，所生成的乙醛也不能作为受氢体，两个乙醛分子起歧化作用，相互氧化还原，生成等量的乙醇和乙酸，这时，硫酸二羟丙酮又成为NADH+H+的受氢体，总的产物为甘油，乙酸，乙醇，和CO2.总反应式为:

C6H12O6+2ADP+2H3PO4→2CH3CHOHCOOH+2ATP+135.56KJ

理论转化率:

2×90/180×100%=100%乳酸链球菌、酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌同型乳酸发酵是指发酵终产物中90％以上为乳酸的乳酸发酵过程。

同型乳酸发酵(Homofermentationof

lacticacidpatheay)糖酵解途径（EMP）丙酮酸脱氢酶异型乳酸发酵

Heterofermentationof

lacticacidpatheay

总反应式为:

C6H12O6→CH3CHOHCOOH+CH3CH2OH

理论转化率:

90/180×100%=50%磷酸戊糖途径（HMP)肠膜明串珠菌、葡聚糖明串珠菌

是指发酵终产物中除乳酸外，还有乙醇、乙酸和二氧化碳等成分的乳酸发酵过程。

磷酸解酮酶双歧途径

Bifidumpatheay

总反应式为:

2C6H12O6→2CH3CHOHCOOH+3CH3COOH

理论转化率:

(2×90)/(2×180)×100%=50%磷酸解酮酶途径（HK）6-磷酸果糖酮解酶5-磷酸木酮糖磷酸酮解酶柠檬酸生物合成途径丙酮酸羧化酶丙酮酸脱氢酶柠檬酸合成酶第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK）

Δ柠檬酸和ATP对该酶有抑制

生产菌需要解除该抑制作用ΔAMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶的抑制，NH4+浓度与柠檬酸生产速度有密切关系，正是细胞内NH4+浓度升高，使PFK对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量磷酸果糖激酶1.糖酵解及丙酮酸代谢的调节ΔMn2+的影响：Mn2+缺乏HMP和TCA循环酶水平低，生长期菌丝体的蛋白质、核酸和脂肪含量明显减少，氨基酸和NH4+水平升高Mn2+缺乏可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解NH4+水平升高减少柠檬酸对PFK的抑制Mn2+缺乏高糖NH4+↑GluGlnOrnArg氨基丁酸蛋白质和RNA转换过程中细胞蛋白的再合成受损伤1.糖酵解及丙酮酸代谢的调节丙酮酸羧化酶和丙酮酸脱氢酶的平衡1.糖酵解及丙酮酸代谢的调节丙酮酸羧化酶丙酮酸脱氢酶柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键。丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制及微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合成能力。2.三羧酸循环的调节——柠檬酸合成酶顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸------顺乌头酸正逆反应的酶，作用需要Fe2+。（1）添加Fe2+络合物（2）筛选该酶缺失或活力降低的菌株（3）随着柠檬酸的积累，高酸环境可进一步造成顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活2.三羧酸循环的调节——顺乌头酸水合酶2.三羧酸循环的调节—NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶黑曲霉中只有一种NAD-异柠檬酸脱氢酶，且活力很低。NADP-异柠檬酸脱氢酶有两种：（1）细胞质中的不受柠檬酸抑制（2）线粒体中受生理浓度柠檬酸抑制。一旦柠檬酸积累到一定水平，就能抑制其自身的进一步分解，从而促进自身的积累2.三羧酸循环的调节——α-酮戊二酸脱氢酶

在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点是，α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和NH4+的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：①TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。②α-酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。

乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：(1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。(2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。

2.三羧酸循环的调节--氧对柠檬酸积累的调节

当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。2.三羧酸循环的调节——氧对柠檬酸积累的调节柠檬酸的积累机制小结：①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑，形成一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链，解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通。②丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，草酰乙酸合成有保证。③丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。柠檬酸的积累机制小结：

④顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7，同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。⑤随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。柠檬酸的积累机制小结：α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和NH4+的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。α-酮戊二酸抑制异柠檬酸脱氢酶的活性，促使柠檬酸的积累柠檬酸发酵过程的控制要点（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，使EMP畅通无阻。（3）控制培养基中的Fe2+的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。（2）

控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。氨基酸发酵的代谢调控1控制旁路代谢2降低反馈作用物的浓度3消除终产物的反馈抑制与阻遏4控制细胞渗透性5控制发酵的环境6促进ATP的积累以利氨基酸的生物合成一、谷氨酸生物合成途径及调节机制3mol醋酸：1mol柠檬酸生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸酵母N源耗尽后开始烷烃发酵，低浓度AMP抑制NAD-异柠檬酸脱氢酶的活性，柠檬酸大量合成并积累。此时顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸=90：7：3。细胞质中积累大量异柠檬酸。谷氨酸生产菌中存在2个糖酵解途径EMP/HMP生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度丙酮酸积累亚砷酸抑制EMP途径：HMP途径90％：10％生物素HMP38%HMP26%黄色短杆菌产氨短杆菌TCA循环柠檬酸合成酶乌头酸酶异柠檬酸脱氢酶拮抗氟乙酸氟乙酸抗性株谷氨酸产量升高氟乙酸是乌头酸酶的专一抑制剂α－酮戊二酸脱氢酶活力低α－酮戊二酸积累NH4+谷氨酸脱氢酶谷氨酸α-酮戊二酸脱氢酶ATP3C6H12O6→6C3H4O3→6CH3COOH＋6CO26CH3COOH+2NH3+3O2→2C5H9O4N+2CO2+6H2O以葡萄糖为原料的谷氨酸发酵中，特别是在谷氨酸生成期DCA循环应关闭异柠檬酸裂解酶TCA循环的中间产物异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸裂解酶＜抑制黄色短杆菌Km0.01mmol/LKm0.8mmol/L有机酸浓度低时→DCA循环有机酸浓度高时→TCA循环在谷氨酸发酵中，DCA环一方面可以作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量作用DCA循环异柠檬酸脱氢酶CO2固定Δ在生产菌中检出CO2固定反应酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶谷氨酸对糖的转化率达到81.7%PEP乙酰CoA草酰乙酸、PEP羧化酶丙酮酸激酶PEP浓度低时→乙酰CoA与二磷酸果糖不能激活PEP羧化酶→分解乙酰CoA浓度增加，与二磷酸果糖共同激活PEP羧化酶，→CO2固定增加TCA循环中间产物浓度→天冬氨酸↑→反馈抑制PEP羧化酶→分解→防止草酰乙酸↑当乙酰CoA氧化→ATP↑→丙酮酸激酶抑制→CO2固定氨的导入合成谷氨酸的反应有3种：+α-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸转氨酶α-酮戊二酸+α-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶α-酮戊二酸+NH4+NADPH谷氨酸H2ONADP++谷氨酸脱氢酶生产菌中谷氨酸脱氢酶是合成积累谷氨酸的主要酶谷氨酸转氨酶活力低，转氨作用可以不考虑谷氨酸合成酶由于不受高浓度谷氨酸抑制，其作用值得重视谷氨酸+α-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸α-酮戊二酸+谷氨酸α-酮戊二酸+为何谷氨酸合成酶在合成谷氨酸过程中值得重视？谷氨酸合成酶的KmNH4+只有谷氨酸脱氢酶的1/10，当环境中NH4+浓度很低时，由该途径合成谷氨酸。当细胞内谷氨酸浓度高时，反馈抑制谷氨酸脱氢酶活性，但不抑制谷氨酸合成酶。异柠檬酸脱氢酶（NADP）与谷氨酸脱氢酶（NADPH+H+）形成共轭体系，在活细胞中异柠檬酸脱氢酶活性总比谷氨酸脱氢酶低谷氨酸为何说NADP浓度是限速因子，决定谷氨酸的产量？生物素和NH4+对谷氨酸发酵如何影响？生物素缺乏，NH4+提高糖代谢速度高效合成谷氨酸生物素充足时，NH4+不影响糖代谢速度细胞膜通透性控制结论：谷氨酸分泌是由细胞膜控制的。结论：细胞膜的谷氨酸通透性受细胞膜的磷脂含量控制菌种选育模型细胞膜通透性细胞膜磷脂含量磷脂不饱和脂肪酸甘油磷酸侧链控制油酸合成控制甘油合成控制磷脂合成生物素缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成磷脂含量减少，影响细胞膜的合成饱和脂肪酸表面活性剂对生物素有拮抗阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成在对数生长期添加青霉素抑制细胞壁合成细胞膜损伤甘油缺陷型磷脂的合成受阻影响细胞膜的合成油酸缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成影响细胞膜的合成菌种选育模型(1)细胞生长期到抗生素产生期的过渡

次级代谢产物是在菌体生长到达相对静止期才产生。在细胞生长阶段,负责次级代谢产物合成的酶处于抑制状态。

A.诱导因子在生长期末积累或从外源加入;

B.初级代谢的终产物耗尽解除反馈阻遏作用;

C.易被利用的糖源分解代谢物被利用后,便解除了阻遏作用;

D.高能化合物ATP形成减少后，阻遏作用也就解除;

E.在生长期，RNA聚合酶只能启动生长期基因的转录作用；当生长停

止后,酶的结构改变,允许RNA聚合酶启动生产期基因的转录作用,

负责抗生素合成的酶开始生成。

抗生素生物合成的调节机制(3)分解代谢产物的调节控制碳、氮分解代谢产物(如葡萄糖)阻遏和抑制作用,抑制抗生素合成。在抗生素发酵过程中，若供给高浓度的无机氨态氮或其他容易被利用的氮源，会促进菌体生长，强烈抑制抗生素的合成。葡萄糖效应glucoseeffect(2)酶的诱导作用

在抗生素合成期,参与次级代谢的有些酶是诱导酶。

需要底物或底物的结构类似物(外源和内源诱导剂)。(3)分解代谢产物的调节控制解除分解产物阻遏的方法:

A.选育对葡萄糖代谢产物类似物抗性突变型;

B.培养过程中利用缓慢的碳源和氮源,连续流加葡萄糖和无机氨态氮;C.使用含有慢慢向培养基内渗透营养物质的颗粒。

（4）磷酸盐的调节1抗生素只有在磷酸盐含量控制在生长的“亚适量”时才能合成。2磷酸盐抑制抗生素合成的机制可能有以下方面：A.抑制或阻遏抗生素生物合成途径中有关酶的活力和合成。B.改变代谢途径。(HMP→EMP，减少抗生素的芳香族前体合成)C.磷酸盐可调节细胞内ATP的形成。

(5)初级代谢产物的调节A.有一条共同的合成途径,当初级代谢产物积累时,反馈抑制了某一步反应的进行,而最终抑制了次级代谢产物的合成。B.初级代谢产物直接参与次级代谢产物的生物合成,反馈抑制了它自身的合成时,必然也同时影响了次级代谢产物的合成。如缬氨酸是合成青霉素的前体，其生物合成受到反馈调节，必然对青霉素的合成有影响。(6)次级代谢产物的自身反馈调节抗生素本身的过量积累，存在着与初级代谢相似的反馈调节现象。如氯霉素、卡那霉素、泰乐菌素、制霉菌素、瑞斯托霉素等抗生素都对本身的合成有抑制作用。

产生菌抗生素的生产能力与自身抑制所需抗生素浓度呈正相关性。因此要选育生产能力强的抗反馈调节的突变菌株。(7)细胞膜透性的调节细胞膜的通透性影响胞内合成及代谢物分泌和发酵产物收获。

例：在青霉素发酵中,生产菌细胞膜输入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的高低。诱变选育出来的青霉素高产菌株中，改变了细胞膜的通透性，使硫酸盐更容易透过细胞膜，提高了胞内硫酸盐浓度，进而促进了青霉素前体物半胱氨酸的合成，最终提高了青霉素的产量。(8)次级代谢的能荷调节A.能荷调节机制对次级代谢途径的控制是有效的。B.抗生素生产菌株的ATP含量在生长期中迅速增加,而在抗生素形成期ATP含量迅速下降,并保持在较低的水平上。高ATP含量不利于抗生素的积累。C.磷酸盐可通过增加ATP的含量来影响抗生素的生产。（9）金属离子和溶解氧的调节★在多数情况下，微量的金属离子是参与次级代谢产物合成酶的活化因子，甚至有时在转录和转译水平上起作用。如，Mg2+可增加卡那霉素合成中的卡那霉素乙酰化酶、乙酰卡那霉素胺基化酶和弗氏链霉菌的碱性磷酸酶的活力，促进这些酶的合成。★有些金属离子（如Mg2+和Ca2+等）可解除产生菌（卡那霉素、新生霉素和链霉素等产生菌）对所产抗生素的特异性吸附作用，使抗生素从菌丝上游离下来，促进产物分泌。★还有一些金属离子（如Mg2+）可增加产生菌对所产抗生素的抗性。★次级代谢产物的发酵过程需要适量的溶解氧，溶解氧的降低影响次级代谢产物的生物合成。例如，由青霉素N进行头孢菌素合成时，氧分压的增大促进头孢菌素的合成，同时降低搅拌速度合成量则减少。什么是发酵动力学？研究内容：微生物生长过程中的质量和能量平衡，发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关系，环境因素对三者的影响以及影响反应速度的条件。发酵动力学：发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在的规律。发酵分类（按发酵动力学原则）Gaden分类法Ⅰ型——生长联系型（简单发酵型）Ⅱ型—部分生长联系型（中间发酵型）Ⅲ型——非生长联系型（复杂发酵型）Ⅰ型——生长联系型（简单发酵型）产物直接由碳源代谢而来，产物生成速率的变化与微生物对碳源利用速度的变化相平行，产物生成和糖的利用有直接的化学计量关系，产物形成与微生物生长相偶联。酒精发酵酵母菌体培养菌体生长碳源消耗产物生成Ⅱ型——部分生长联系型（中间发酵型）产物不是碳源的直接氧化产物，而是菌体内生物氧化过程的主流产物，碳源既供微生物的生长又供产物生成，糖的消耗主要在微生物的旺盛生长阶段和产物最大形成期，但糖的消耗与产物合成无直接计量关系，产物生成与微生物的生长部分偶联。黑曲霉柠檬酸发酵土霉素生产菌体生长碳源消耗产物生成Ⅲ型——非生长联系型（复杂发酵型）产物合成与碳源利用无准量关系，产物生成量远远低于碳源消耗量，产物生成在菌体和基质消耗完以后才开始，与生长不偶联，所形成产物均是次级代谢产物。青霉素和链霉素生产菌体生长碳源消耗产物生成1.生长速率细胞浓度，g/L限制性基质浓度，g/L抑制剂浓度g/L生长速率,g/(L·h)产物形成动力学1生长联系型模式（初级代谢产物）当底物以化学计量关系转变成单一的一种产物P时，产物形成速率与生长速率成正比2非生长联系型模式（次级代谢产物）产物的形成速率只和细胞浓度有关

3复合模式比生产速率，单位菌体的产物生成速率，g产物/（g细胞·h)或1/h对于生长联系型，比生长速率与比生产速率成正比对于非生长联系型，比生长速率与比生产速率无关比生长速率比生长速率：单位菌体的生长速率，时间的倒数一般以1/h表示。与多种因素有关，随温度、pH、基质浓度等条件改变比生长速率与基质浓度的关系Monod方程底物饱和(亲和）常数最大比生长速率一级反应当限制性底物浓度非常小时比生长速率与限制性底物浓度成正比，微生物的生长显示为一级反应零级反应当限制性底物浓度很大时比生长速率达到最大比生长速率，菌体的生长速率与底物浓度无关，而与菌体浓度成正比，微生物显示为零级反应。饱和常数KS的物理意义KS为比生长速率等于最大比生长速率的一半时的底物浓度同一微生物菌体，对不同的基质具有不同的饱和常数KS，而具有最小KS值的底物为微生物生长的天然底物。KS的大小反映了比生长速率对底物浓度的敏感性。当KS较大时，μ值变化小，微生物对基质的敏感性小当KS较小时，μ值变化大，微生物对基质的敏感性大生长得率与产物得率生长得率消耗每单位数量的基质所得到的菌体量产物得率

消耗每单位数量的基质所得到的产物量理论生长得率和表观生长得率理论得率

只考虑细胞合成时细胞对底物的得率叫做生长的理论得率。表观得率

既考虑合成又考虑细胞维持时细胞对底物的得率叫做生长的表观得率。理论生长得率与表观生长得率的区别和联系理论得率只取决于细胞的组成与合成途径与生长速率无关，表观得率与生长速率及培养条件有关在生长速率较高时，生长速率很低时，表观得率可在培养过程中随时测定，而理论得率不能直接测定≈＞第三节发酵培养方法培养基液体发酵固体发酵浅层发酵深层发酵分批发酵补料分批发酵连续发酵深层液体发酵

liquidsubmergedfermentation深层液体发酵是把菌种接种到发酵罐中，使菌体细胞游离悬浮在液体培养基中，并进行生长和将原料转化为产物的发酵方法。深层液体发酵一般需要通入空气并进行搅拌，是传统的微生物发酵培养方法。

分批发酵

batchculture在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。分批发酵

batchculture

在发酵开始时，将微生物菌种接入已经灭菌的培养基中，在微生物最适宜的培养条件下进行培养，在整个培养过程中，除氧气的供给、发酵尾气的排出、消泡剂的添加和控制pH需加入的酸或碱外，整个培养系统与外界没有其他物质的交换。分批发酵特点：1.培养基一次灭菌，一次投料，容易实现无菌状态2.易于操作控制，产品质量稳定3.培养浓度较高，易于产品分离4.辅助时间较多，设备生产能力低补料分批发酵（流加培养）

fed-batchculture

先将一定量的培养液装入反应器中，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，向反应器中不断补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，到反应终止时取出整个反应系。补料内容和原则内容：碳源氮源微量元素和无机盐诱导物原则：控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。分批补料发酵的特点：可解除底物抑制和分解代谢物的阻遏防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长而产生的一切影响，改善发酵液流变学的性质连续发酵

continuousculture

以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物发酵方式微生物细胞的生长速率、产物代谢均处于恒定状态，可以达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量的代谢产物的目的连续发酵特点：1.维持低基质浓度，避免有毒代谢物积累2.设备生产能力高、易于实现自动控制和劳动生产率高3.很难保证长期的无菌操作，菌种易发生变异4.培养浓度较低，不易于产品分离三种不同发酵工艺适用的范围。分批发酵：发酵过程不存在明显的底物抑制，发酵周期长补料分批发酵：存在底物抑制的发酵生产，营养物浓度高导致副作用的发酵生产。连续发酵：菌体比生长速率较高的发酵生产，不易杂菌污染的发酵生产。连续培养模型全混式（COST）进料液＝出料反应器中无浓度梯度流出液物料＝反应器中物料连续培养模型活塞流式（PFR）物料先进先出细胞浓度和营养组分浓度沿反应器轴向变化，径向无变化反应器各处各组分浓度不随时间变化单级连续培养洗出当稀释率提高到使反应器中底物浓度S接近进料液中的底物浓度SO时，反应器中细胞浓度将趋于零，整个连续培养过程也就完全破坏了。称为洗出现象。

连续过程的最大稀释率也称为临界稀释率：发生洗出时的稀释率DC工业生产使用发酵罐的基本条件(1)应具有严密的结构。(2)良好的液体混合特性。(3)较高的传质、传热速率。(4)具有配套而又可靠的检测、控制仪表。3．按容积分类：500L以下的是实验室发酵罐；500-5000L是中试发酵罐；5000L以上是生产规模的发酵罐。密闭厌氧发酵罐：酒精、乳酸通气好氧发酵罐：柠檬酸、谷氨酸

2.按照发酵罐设备特点分类：机械搅拌通风发酵罐：

循环式：伍式发酵罐，文氏管发酵罐非循环式：通风式发酵罐和自吸式发酵罐非机械搅拌通风发酵罐：

循环式：气提式、液提式发酵罐非循环式：排管式和喷射式发酵罐。密闭厌氧发酵罐搅拌器搅拌器有平叶式、弯叶式、箭叶式三种其作用是打碎气泡，使氧溶解于醪液中，从搅拌程度来说，以平叶涡轮最为激烈，功率消耗也最大，弯叶次之，箭叶最小。机械搅拌发酵

罐的结构1、罐体2、搅拌器和挡板3、消泡器

4、联轴器及轴承5、变速装置

6、空气分布装置7、轴封8、冷却装置

2、微生物工程下游工程的一般程序成品加工发酵液的预处理和固液分离提取精制改变发酵液性质，固液分离以及细胞破碎提取（初步纯化）目的是除去与目标产物性质差异大的杂质精制（高度纯化）是采用对产品有高度选择性的分离技术，除去与产物化学性质和物理性质相近的杂质最终获得质量合格的产品2.下游加工过程的一般流程（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）发酵液初步纯化细胞碎片分离细胞破碎细胞分离高度纯化成品加工预处理胞外产物（加热、调pH、絮凝）（过滤、离心分离、膜分离)（匀浆、研磨、酶解）（离心分离、双水相萃取、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）胞外产物提取精制——产品的收得率和质量控制。复习题：发酵液细胞破碎固液分离预处理初步提纯精制成品（加热、调pH、凝集、絮凝）（过滤、离心分离、膜分离)（匀浆、研磨、酶解）（沉淀、吸附、萃取、离子交换、膜分离）（重结晶、色谱分离、电泳）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）1）发酵液预处理的意义和方法目的：分离菌体和其他悬浮颗粒，除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各工序的顺利进行。方法选择：根据对产品的要求来选择1采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度；2或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤2.改善发酵液过滤特性的物理化学方法

通过对发酵液进行适当的预处理，即可改善其流体性能降低滤饼比阻，提高过滤与分离的速率1）降低液体粘度：①

加水稀释法②升高温度2）调整pH：3）凝聚与絮凝：凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。4）加入助滤剂：助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，吸附胶体，扩大过滤面积，滤速增大。常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土炭粒、淀粉等，其中最常用的是硅藻土。5）加入反应剂：复习题：1.常用的层析技术包括：离子交换层析、亲和层析、分子筛层析、分配层析。2.产生均一结晶的条件1纯度高2.饱和介稳态3.合适的温度和溶剂3.电泳分离的原理1.电泳淌度2.分子筛效应常见层析技术的总结名称分离原理吸附层析法组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离影响发酵过程的主要因素温度pH溶解氧菌体浓度和基质浓度二氧化碳和呼吸商泡沫温度控制措施：发酵温度的确定应根据发酵的不同阶段，确定其最适温度。在发酵的前期应选择菌体的生长温度；在产物分泌阶段应选择有利于代谢产物积累的温度。

温度的选