色谱分析法导论

色谱分析法导论一、色谱分析概论问题问题1：什么是色谱法？问题2：为什么色谱法能将混合物分开？问题3：色谱法的分类？问题4：各种色谱法的应用范围？1、什么是色谱法？茨维特的实验茨维特：俄国植物学家，主要从事植物色素的研究工作，在1906

年发表的文章中，首次提出了色谱的概念。茨维特的实验因此色谱法是一种分离方法。它的特点是：有两相，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。Chromatography将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。色谱分析是一种分离、分析法。2、色谱法分离原理当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。3、色谱法的分类

按流动相状态的不同，可分为气相色谱法(GC)液相色谱法(LC)超临界流体色谱(SFC)什么是气相色谱法？以气体为流动相的色谱法GasChromatogaphy，简称GC按固定相状态的不同可分为：气固色谱(GSC)气液色谱(GLC)适合分离分析易汽化（在-190℃-500℃范围内有的蒸气压的）稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的分离。什么是液相色谱法？以液体为流动相的色谱法LiquidChromatogaphy，简称LC适合分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。应用举例(HPLC)按固定相使用的形式可分为柱色谱（ColumnChromatography）将固定相装在色谱柱内纸色谱（PaperChromatography）用滤纸做固定相或固定相载体的色谱薄层色谱（ThinLayChromatography）固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上

关于分配平衡分配系数K(distributioncoefficient)分配比k又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。相比β

色谱柱内固定相和流动相体积之比

是柱型及结构的重要特征。

4.色谱相关术语关于色谱峰关于保留值关于分配平衡

关于色谱峰的术语峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差σ

色谱峰宽（区域宽度）峰底宽Wb

在色谱峰两边的转折点所画的切线与基线相交的截距。标准偏差σ拐点间距离的一半

半峰宽度峰高一半处的峰宽度

W

1/2=2.354σ

峰底宽

Wb=4σ

拐点处峰宽

Wσ=2σ

（4）色谱图的信息

a.色谱峰个数判断试样中所含组分的最少数

b.色谱保留值定性

c.色谱峰面积或峰高定量A=KCd.保留值与区域宽度评价柱分离效能依据

e.两峰间距评价两组分能否分离

关于保留值的术语死时间(tM):无保留组分出峰时间保留时间(tR):从进样开始到色谱峰最大值出现所需时间调整保留时间(t’R):死体积(VM):保留体积(VR):

调整保留体积(V’R):相对保留值ɑ：二、色谱分析法基本理论研究理论的目的解决色谱峰的分离问题三个色谱基本理论问题色谱热力学问题——发展高选择性色谱柱色谱动力学问题——发展高效能色谱柱分离条件的最优化问题——分离条件优化1、色谱动力学理论

研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影响因素塔板理论速率理论（1）塔板理论推导

塔板理论将色谱柱比作精馏塔，通过概率理论得到流出曲线方程：为标准偏差当t=tR时，C=Cmax，峰高正比于进样量C0，是峰高定量的理论基础。当n越大，柱效越大，Cmax/C0越大。即保留时间一定时，塔板数越多，峰越高。Cmax反比于tR，tR小，Cmax大，保留时间小的组分峰高且窄。tR大，Cmax小，保留时间大的组分峰低且宽。

对色谱流出曲线方程的讨论

柱效

由流出曲线方程导出：

H=L/nn是峰相对展宽的量度n是柱效的量度n是常数时，W与tR

成正比n越大，H越小，表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多，对分离越有利，但还不能预言各组分有被分离的可能性。

塔板理论的贡献塔板理论有助于我们形象的理解色谱的分离过程。导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现象相吻合。导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标。

塔板理论的局限塔板高度H是一个抽象的物理量，它的色谱本质是什么？它与哪些参变量有关，又怎样影响峰的扩张？对实验的指导意义有限。不能解释流速对理论塔板数的影响。有些假设不合理，如没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响等。（2）速率理论概述速率理论是1956年荷兰学者VanDeemter等提出，因此又称作范第姆特方程。运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰扩展的因素，导出了理论塔板高度与流动相线速度的关系，揭示了影响塔板高度的动力学因素。

气相色谱中速率方程的导出速率理论讨论的是色谱峰展宽原因，即影响塔板数n的因素，也就是影响塔板高度H的因素。H=A+B/u+Cu涡流扩散项A=2λdp涡流扩散项均匀性因子粒径

涡流扩散项A

由不等路径造成的色谱峰扩展。由于柱填料粒径大小不同，粒度分布范围不一致及填充的不均匀，形成宽窄、长短不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形成紊乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄且直的路径运行，以较快的速度通过色谱柱，发生分子超前，反之，有些分子发生滞后，从而使色谱峰产生扩散。

分子扩散项B/u项其中B=2γDg弯曲因子扩散系数

分子扩散项由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。即由于试样组分被载气带入色谱柱后，是以塞子的形式存在于色谱柱的很小一段空间中，由于在塞子前后存在浓度梯度，因此使运动着的分子产生纵向扩散，引起色谱峰扩展。

传质阻力项由气相传质阻力和液相传质阻力两项组成

气相传质阻力项Cgu

试样组分从气相移动到固定相表面的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子随流动相向前运动，发生分子超前，引起色谱峰扩展。

容量因子

液相传质阻力项CLu

试样组分从固定相表面移动到固定相内部再回到表面的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子先离开固定相表面，发生分子超前，引起色谱峰扩展。

液相扩散系数液膜厚度气相色谱中的速率方程

速率方程给我们的什么启示？为柱型的研究和发展提供理论依据为操作条件的选择提供理论指导为色谱柱的填充提供理论指导对柱型研究和发展的影响（1）A=0?Golay1957年提出毛细管柱的概念（opentube）毛细管柱A=0，H=B/u+CuH↓，N↑，分离能力大大提高对柱型研究和发展的影响（2）B=0?溶质在液体中的扩散系数DL≈10-5cm2/s溶质在气体中的扩散系数Dg≈10-1cm2/sDL《Dg当采用液体作流动相时

B→0液体作流动相时可用更细的固定相，A↓HPLC柱效比GC要高2~3个数量级操作条件对柱效的影响（1）H-u曲线载气线速度（流速）的影响最佳流速：u=(B/C)1/2实用最佳流速：比最佳流速更快A与流速无关B/u：当流速小时，对H的大小起主导作用Cu：当流速大时，对H的大小起主导作用容量因子k的影响不同组分k不同，测出的柱效不同在气相传质阻力相中，k↑

，Cg↑理论上说k越小柱效越高，实际不可取在液相传质阻力相中，k↑，Cl先↑，后↓当k=1时，最大。希望k在一个合适的范围内，通过改变柱温、固定相、柱型参数等可实现。柱温的影响间接影响、十分复杂对k影响，对扩散系数影响，从而对柱效产生影响，但影响情况难以判断对色谱柱的填充提供理论指导（1）柱径：柱径越小，固定相越难填充均匀。柱长L：柱长增加，总塔板数增加，但分离时间将增加。固定相粒径dp：根据速率方程，粒径减小，A项减小，C项减小，柱效增加。但粒径太小，不易填充均匀，A项又增大。对色谱柱的填充提供理论指导（2）液膜厚度df：从柱效角度考虑，液膜越薄，柱效越高（根据速率方程），但允许的进样量减小。（1）几个概念——选择性系数α定义与相对保留值(ri,s)基本相同不同之处在于选择性系数是两个相邻峰的调整保留值之比（后峰比前峰，α≥1），而不是被测物与标准物质的调整保留值之比（可小于1）它是评价固定液选择性的指标。选择性系数越大，该柱对此相邻峰的分离越好。

几个概念——有效塔板数N有效在气相色谱中，通常用有效塔板数N有效和有效塔板高度H有效来评价柱子的分离效能，它扣除了死体积对分离的影响，更好地反映了柱子的实际分离效能。柱效越高，该柱的分离能力越好。几个概念——分离度RR越大，说明两组分分离得越好。由于该定义综合了色谱动力学和热力学因素，可作为色谱柱的总分离效能指标。(2)色谱分离基本方程（Purnell方程）

公式推导（3）色谱分离基本方程的启示要改善物质对的分离（提高R），即提高两相邻物质的分离度，可以采取以下措施：提高柱效N提高选择性系数α增大容量因子kN的影响，如何提高N？分离度R与理论塔板数N的平方根成正比关系，增加塔板数，有利于提高分离度。增加柱长可增加N，改善分离，但分析时间将大大延长，峰产生扩展。减小塔板高度H：根据速率方程的启示制备一根性能优良的色谱柱是十分重要的。根据速率方程选择合适的色谱条件同样有效。K的影响，如何改变k？分离度与容量因子有关，容量因子越大，分离越好。

k135791113∞但当容量因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将大大延长。因此，k的最佳范围是1<k<10。改变容量因子的方法有：改变柱温改变相比，即改变固定相的量和改变柱死体积，其中死体积对k/(k+1)的影响很大，使用死体积大的柱子，分离度将受到很大损失。在高效液相色谱中改变流动相的配比是最简便、最有效的方法α的影响，如何改变α？αN有效R=1.0R=1.51.001.0051.011.021.051.101.251.502.00∞650000163000420007100190040014065∞145000036700094000160004400900320145相对保留值（选择性因子）α越大，分离效果越好。增大α是提高分离度最有效的手段。改变柱温也可改变α。在气相色谱中，增大α最有效的手段是改变固定相，选择合适的固定相种类是解决分离问题的关键在高效液相色谱中，流动相的种类和配比是改善分离最简便有效的方法。（4）分离度究竟要多大？一般来说R应大于。具体工作中应根据样品要求和定量方法来确定。例如：含量50%的组分，要使峰高定量误差小于1%，需达到R1/2，而采用峰面积定量R1/2需。含量1%的组分，要使峰高定量误差小于1%，需达到R1/2，而采用峰面积定量R1/2需。3.气相色谱操作条件的选择流速柱温气化温度检测器温度进样量载气种类固定相种类流速u（Fc）根据速率方程，可计算求出最佳流速，此时柱效最高。在实际工作中，为缩短分析时间，往往使流速稍高于最佳流速。具体的：对于填充柱，氮气的实用最佳线速为10-15cm/s；氢气为15-25cm/s；氦气介于两者之间。若填充柱内径为4mm，则体积流速为氮气30-40ml/min，氢气40-60ml/min。柱温Tc直接影响分析效能和分析速度。每一种固定液都有它的最高使用温度，柱温不可超过这一温度，否则固定液挥发流失。柱温太高，组分挥发度靠拢，不利于分离。但柱温太低，被测组分的扩散速度下降，分配不能快速达到平衡，影响峰型，柱效下降，并使分析时间大大延长。柱温选择的原则是，在保证难分离物质有良好分离的前提下（分离度满足要求），尽可能采取较高柱温，以缩短分析时间，保证峰型对称。汽化温度一般进样方法下，汽化温度比柱温高30-70℃。进样量大时高一些好，保证瞬间汽化。保证不可超过试样的分解温度。其它气化温度与具体进样方式有关。检测器温度一般大于或等于柱温，具体与检测器种类有关。进样量液体试样一般进样量。气体试样一般进样量为。具体视柱类型，固定液含量（不能超过柱容量）、进样方式、检测器的灵敏度和线性范围等确定。流动相（载气）种类流动相的种类要视检测器种类确定。常用的有氢气（热导用）、氮气（氢火焰用）、氦气（均可用，但价格较高）。氢气和氦气适合于快速分析。氮气做载气峰型较好，柱效较高。三、色谱定性与定量方法1.色谱定性分析(1)利用保留值及其规律定性各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此保留值可作为定性指标。利用纯物对照定性利用文献值对照定性纯物质对照定性实现方法利用保留时间和保留体积定性

用相对保留值定性

用已知物增加峰高法定性

应用范围：适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。优点：应用简便，不需要其他仪器。缺点：定性结果的可信度不高。提高可信度的方法：双柱、双体系定性文献值对照定性分析（GC）实现方法测定相对保留值ri,s测定保留指数I

优点：无需纯物质；保留指数具有较好的重现性和精密度；只与固定相和柱温有关。缺点：对结构复杂的物质，缺乏数据。

适用范围：适用于简单混合物，无需纯物质。(2)与其它仪器或化学方法联合定性离线联用方式化学法仪器法在线联用方式化学法仪器法离线联用方式收集方法：GC中一般采用液氮冷阱冷却后收集应用范围：无标准物时，可对较为复杂的混合物进行定性分析缺点：麻烦在线联用方式用化学方法辅助定性柱前反应：在色谱柱前装上预处理柱，带有某些官能团的化合物在预柱中发生物理化学变化，其色谱峰会消失或移动，与反应前色谱图比较，可初步判断试样中含那些官能团。柱后反应：在色谱柱后装上Ｔ型毛细管分流器，将各组分导入官能团试剂反应管，利用官能团反应对组分进行定性。与其它仪器联用定性

混合物经色谱分离后，将各组分直接由接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS……

其它仪器相当于色谱仪的检测器。使用范围：复杂样品的定性。优点：不需要标准物，定性结果可信度高，操作方便。缺点：需要特殊仪器或设备。GC-MS2色谱定量分析(1)色谱定量基础色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。在一定色谱条件下有：（2）定量要解决的问题峰面积的测量和计算校正因子的测量与计算色谱定量方法及其应用峰面积的测量与计算积分仪或色谱工作站简便、速度快，精度