第十四章免疫学检测技术

第十四章免疫学检测技术主要内容一、Ag或Ab检测二、细胞免疫检测三、细胞因子检测一、Ag或Ab检测抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（serologicalreaction)应用：用已知抗原检测未知抗体；用已知抗体检测未知抗原：定性或定量检测体内各种分子；用已知抗体检测半抗原物质。1.特异性和交叉反应

特异性：一种抗原通常仅能与由它刺激所产生的抗体结合。分子基础：抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性。（一）抗原-抗体反应的特点交叉反应（crossreaction）性：若两种抗原分子有一个或数个相同（或相似）的决定基，则针对一种抗原的抗血清可与另一种抗原发生反应。结合价：天然抗原分子表面一般含多种抗原决定基，可与多个抗体分子结合，为多价。单体形式的抗体分子有两个Fab段，能结合两个相同的抗原决定基，为两价。

2.比例性比例合适：若抗原、抗体的数量比例合适，抗体分子的两个Fab段分别与两个抗原决定基结合，相互交叉连接成网格状复合体，则反应体系中基本不存在游离的抗原或抗体，此时形成肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物）。因此，确定反应体系中抗原、抗体的最适比例十分重要。前带现象（prozone）和后带现象(postzone)

Ab过剩和Ag过剩抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现象，与两者的浓度和比例密切相关前带现象（prozone）和后带现象(postzone)Ab过剩和Ag过剩网格学说（latticetheory）抗体过剩抗原过剩抗体抗体比例合适抗原抗体抗原-抗体反应为分子表面的非共价结合，结合虽稳定但可逆。在一定条件下（如低pH、高浓度盐、冻融等），抗原-抗体复合物可被解离。解离后的抗原和抗体仍保持原有理化特性和生物学活性。根据此特点，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。3.可逆性4.阶段性抗原抗体反应可分为两个阶段

特异性结合阶段：反应快，不可见。

可见的反应阶段：反应慢，出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象。

1.电解质

抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原-抗体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应，故免疫学试验中多用生理盐水稀释抗原或抗体。（二）、抗原-抗体反应的影响因素2.酸碱度抗原抗体反应的最适pH是6-8。3.温度最适温度为37℃。有些例外，如冷凝集素在4℃左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。

4.抗原和抗体的性质抗体的特异性和亲和力是决定抗原-抗体反应的关键因素。此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和种类等均可影响抗原-抗体反应。

抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定基之间的结合能力亲和力(affinity)

根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反应的成分等因素分类：

1.凝集反应

2.沉淀反应

3.补体参加的反应

4.中和反应

5.免疫标记技术（三）、Ag-Ab反应的基本检测方法

反应类型实验技术非标记凝集反应直接凝集试验、间接凝集试验、间接抑制凝集试验、协同凝集试验沉淀反应液相内凝集试验、凝胶内凝集试验补体参与的反应补体溶血试验、补体结合试验中和反应病毒中和试验、毒素中和试验标记标记免疫反应荧光免疫技术放射免疫技术酶免疫技术发光免疫技术金免疫技术颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应(agglutination)

。用于凝集反应中的抗原称凝集原(agglutinogen)。用于凝集反应中的抗体称凝集素（agglutinin)。

凝集反应（AgglutinationTests）1．直接凝集（directagglutination)

：

细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或红细胞凝集现象。2．间接凝集（indirectorpassiveagglutination)：检测针对可溶性Ag的Ab3．间接凝集抑制试验

(directagglutinationinhibitiontest)4.协同凝集试验（co-agglutinationtest）妊娠免疫诊断试验

孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（HCG）含量明显增高。（HCG是可溶性抗原）反之，非孕妇尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗体。Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、细菌滤液等）与相应抗体结合，在一定条件下，形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。沉淀反应（PrecipitationTests）

用于沉淀反应中的抗原称沉淀原(precipitonogen)。用于沉淀反应中的抗体称沉淀素（precipitin)。

大多沉淀反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形成可见的白色沉淀。1．单向免疫扩散(singleimmunodiffusion)2．双向免疫扩散(doubleimmunodiffusion)3．免疫电泳(immunoelectrophoresis)4．免疫比浊(immunonephelometry)沉淀反应单向免疫扩散

(SingleImmunodiffusion)是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于测定血清IgG、IgM、IgA

和C3等的含量。含抗体的凝胶沉淀环双向免疫扩散

（DoubleImmunodiffusion)是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性、组成和两种抗原相关性分析的检测。免疫电泳

（Immunoelectrophoresis)

免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。两大优点：一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳、免疫印迹等免疫电泳

（Immunoelectrophoresis)是先将待侧血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各蛋白组分被分成不同的区带，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，把分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀弧。该法常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。免疫电泳原理图解火箭电泳（RocketElectrophoresis)

火箭电泳也称单向电泳扩散免疫沉淀试验，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。火箭电泳示意图沉淀线的高度与抗原量成正比补体结合试验（ComplementFixationtest,CFT)

敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。补体结合试验(complementfixationtest，CFT)

将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应系统中抗原或抗体的传统方法。试验原理作用原理：利用补体的溶细胞作用进行各种物理状态的抗原抗体测定5种成分，3个系统反应系统（溶菌系统）：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）补体系统：指示系统（溶血系统）：SRBC与相应溶血素。试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞（sensitizedsheepredbloodcell,SRBCS）。溶菌系统反应分两步进行

第一步:反应系统与补体的作用

第二步:指示系统利用剩余补体的反应不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性已知抗原加入血清（检测抗体）加入标准量补体加入包被抗体的红细胞检测红细胞溶解情况AgYYPatient’sserum

YYYYYYYYAbNoAbAg用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。免疫标记技术（Immunolabellingtechnique）

用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。

1．免疫荧光法(immunofluorescence,IF)（1）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。（2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测,但非特异性反应亦增强。免疫荧光法分类免疫荧光法图示

此法将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（OD）值可反映抗原含量，灵敏度达ng/ml甚至pg/ml水平。常见的标记物为：辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）

２．酶免疫测定(enzymeimmunoassay,EIA)常用的方法如下：（1）酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)（2）免疫细胞或组织化学（immunocytochemistryorimmunohistochemistry,ICCorIHC)1）ELISA是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。优点：灵敏度高、操作简便、稳定性强，可自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等。双抗体夹心法：用于检测特异性抗原。该试验所用的包被抗体与酶标抗体应分别针对不同抗原决定基，或其中之一用多克隆抗体，且相互间应无交叉反应。间接法：用于检测特异性抗体。用已知抗原包被固相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显色反应。ELISA分类应用酶标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。2）免疫细胞或免疫组化技术ICCIHC乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性，检测灵敏度达pg水平。常用于标记的放射性核素为125I和131I，分为液相和固相两种方法。该法常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、IgE等。3．放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)４．化学发光免疫分析将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物质（甲状腺素等激素）。

该法又称Western印迹法，其结合凝胶电泳与固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射免疫等技术进行检测。该法能对分子大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗体或抗原。５．免疫印迹法(immunoblotting)免疫印迹法示意图原理：病毒、细菌、毒素与相应抗体特异结合后，丧失生物活性。用途：1.用已知血清鉴定病毒、细菌、毒素、兽药残留等。2.用已知病毒、细菌检测血清抗体——测定抗体免疫血清效价（中和价）。中和试验（病毒、毒素）二、免疫细胞的检测

检测各群体淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。外周血是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结等作为标本进行检查。（一）淋巴细胞及亚群的分离外周血单个核细胞(PBMC)的分离：葡聚糖－泛影葡胺（即淋巴细胞分离液）密度梯度离心法包含淋巴细胞、单核细胞树突状细胞和其它少量细胞（造血干细胞等）。

密度梯度离心法原理：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。(1)抗凝静脉血(2)加等量NS(4)密度梯度离心血浆分离液RBCPBMCPMN(3)混匀后，缓慢加于分离液上外周血红细胞粒细胞单个核细胞血小板淋巴细胞单核细胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001

1.092密度分类（PBMC）淋巴细胞亚群的分离

淋巴细胞为不均一的群体，可借助其表面标志及功能差异而分为不同的群和亚群。

1．尼龙棉分离法

2．E花环分离法

3．洗淘法

4．流式细胞术(flowcytometry，FCM)

5．磁珠分离技术(1)E花环分离法原理：人类T细胞表面上有能与绵羊红细胞相结合的受体（E受体，CD2）,能与经溴化二氨基异硫基异硫脲氰化物（AET）处理的绵羊红细胞结合，形成稳定的、细胞体积和比重较大的E花环。方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加入分层液→T细胞形成E花环而沉于管底→悬液中为B细胞。E花环E花环实验（2）尼龙纤维分离法原理：B细胞在37℃时易粘附于尼龙棉（聚酰胺）纤维上，而T细胞不具此能力。方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管→洗脱下来的是T细胞。（3）流式细胞术又叫荧光激活细胞分离仪(nuorescenceactivatedcellsorter,FACS)法

原理：

细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴(4000个/s)，每小滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。

激发系统细胞分选系统荧光激活细胞分离仪分离法

检测与讯号处理系统细胞流动系统及气压流速控制系统流式细胞分析仪通过流式细胞仪检测：检测T细胞总数:抗CD3检测CD4+/CD8+T细胞:抗CD4/CD8检测B细胞:抗SmIg（4）磁珠分离术

磁珠分离术是将磁性材料颗粒表面进行外理，微球的核心为小金属颗粒，核心处包裹高分子材料（聚苯乙烯），可结合不同的生物大分子物质（抗原、抗体、核酸等），若微球表面包被有免疫物质则称为免疫磁珠，其兼有免疫配基的性质和磁响应性质，即在磁场中显示磁性，移出磁场时磁性消除。

目前商品出售的磁珠有直径为1～5um等不同的规格，表面活性基团有氨基（－NH2）、羧基（－COOH）和羟基（－OH）等。

包被的免疫物质有：一抗、二抗等。方法：

将包被有关抗体的磁珠与待分离细胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与相应的细胞结合成：细胞－抗体－磁珠复合物，该细胞在磁场中运动与其他细胞产生明显差别。

如采用层析的方法，将层析柱放于强磁场中，与磁珠结合的细胞运动将受限，而未与磁珠结合的细胞将先被洗脱下出来。

再将该柱移出磁场，与磁珠结合的细胞也将被洗脱下来，达到分离目的。单克隆抗体CD3羊抗鼠修饰磁球Biomag抗CD3磁球磁球结合T细胞加入B和T细胞中负向选择正向选择磁架进行分离直接法对细胞进行分类间接法对T细胞进行分离免疫磁珠法细胞分选过程免疫磁珠细胞分选装置（5）亲和板结合分离法原理：各种淋巴细胞亚群具有不同的抗性。①分离CD4+或CD8+细胞，可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。②分离B细胞用抗Ig抗体。③分离有C3受体的细胞用活化的C3包被。将相应抗体结合于塑料平板上抗原阳性的细胞与相应抗体结合二、免疫细胞功能的测定

（一）T细胞功能测定：1.细胞增殖(转化)试验：

可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。*丝裂原主要有PHA、ConA和PWM；*抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念珠菌等；淋巴细胞增殖实验淋巴细胞转化试验（形态学示意图）原理：人T细胞表面有PHA或ConA受体，T细胞在体外受PHA或ConA的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定T细胞的功能。

PHA刺激48-72小时淋巴细胞增殖—3H-TdR掺入法原理：将单个核细胞中加入PHA共同培养，在终止培养前8~15小时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR),经β-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA的3H-TdR掺入量，推测淋巴细胞增殖的程度。MTT(四甲基偶氮唑盐）法原理：在细胞培养终止前数小时加入MTT，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解MTT产生蓝色甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。(2)T细胞介导的细胞毒试验：CTLTc和NK对其靶细胞有直接的细胞毒作用。方法：51Cr(铬)释放法乳酸脱氢酶释放法凋亡细胞检测法

(1)B细胞增殖(转化)试验

(2)溶血空斑形成试验(3)酶联免疫斑点法(ELISPOT):

（二）B细胞功能测定1.B细胞增殖试验

B细胞受有丝分裂原刺激后分裂增殖，温育一定时间后检查抗体形成细胞的数目。小鼠B细胞可用细菌脂多糖为刺激物，人B细胞则用