流式细胞术实验技巧及数据分析教学课件

流式细胞术实验技巧及数据分析

2021/4/171BD公司不同型号流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCanto2021/4/172一流式细胞仪的基本原理

*稳定流动

*激发光斑

*荧光补偿

*荧光素选择二数据分析及开窗2021/4/173FCM原理示意图2021/4/174

层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流的形成要满足雷诺数

dρVRe=<2300，

η式中ρ、η分别为液体的密度和粘滞系数，d和V分别为管道的直径和液体的平均流速。FCM利用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自聚焦作用,为细胞分析分选提供技术保证.

层流技术2021/4/175液流驱动系统（示意图）

流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即P=(1/2)V2

(忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。

2021/4/1762021/4/177

低速高速

不同样本速率形成的样本流

2021/4/178激发光源与光束成形系统2021/4/179.20um64um32um032um聚焦距离激光束聚焦透镜强度光束成形与细胞受照方式这种椭圆形光斑的检测区保证每个细胞分别受到光照且受检时受到一致的光照

FCM的单细胞照明技术2021/4/17109、人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低头要有勇气，抬头要有低气。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:41:21PM11、人总是珍惜为得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人乱于心，不宽余请。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、业余生活要有意义，不要越轨。2023/2/32023/2/303February202317、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32021/4/1712荧光光谱重叠

FITC和PE荧光光谱重叠

2021/4/1713UncompensatedvsCompensatedFL1FL2

利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿”荧光补偿2021/4/1714荧光补偿2021/4/1715Mean值判断补偿2021/4/1716双或多参数荧光抗体的组合标记FITC+PE488525、575绿色、橙色FITC+Tred488525绿色

568615

红色FITC+PeCy5488525、675绿色、红色FITC+ECD488525、625绿色、橙红色F+P+PeCy5488525、575、675绿、橙、红色F+ECD+PeCy5488525、575、675绿、橙红色、红色F+P+PeCy5+APC488525、575绿色、橙色

633670

红色

荧光染料激发波长（nm)发射波长（nm)颜色2021/4/1717

用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。LaserCY7755PEECD620CY5670488nm能量传递染料：2021/4/1718流式细胞术操作流程：培养细胞新鲜组织石蜡包埋单细胞悬液制备荧光抗体标记上机检测表型测定细胞分选继续培养FISHPCR统计学分析2021/4/1719单分散细胞2021/4/1720FSCFSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关2021/4/1721SSCSSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关2021/4/1722细胞散色光信号2021/4/1723细胞荧光测量细胞的自发荧光

未经染色的样品细胞在激发光的照射下可测到有微弱的荧光信号.细胞的特异性荧光

经过各种特异染色的细胞在激发光的照射下可测到较强的荧光信号.2021/4/1724自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图自发荧光信号2021/4/1725特异染色的荧光信号2021/4/1726DNA分析比较2021/4/1727排除双联体细胞2021/4/1728细胞阻滞在G2M期2021/4/1729双克隆细胞周期分析2021/4/1730

溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine，

BrdUrd)是胸苷的一种类似物。它可以替代胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同时可以了解不同细胞的DNA合成能力高低。

BrdUrd和DNA双标记染色2021/4/17312021/4/1732BrdUrd与PI检测2021/4/1733BrdUrd与PI检测2021/4/1734BrdUrd与PI检测2021/4/1735细胞三色荧光检测2021/4/1736细胞因子测定*检测T细胞(CD69)活化2021/4/1737G6=R1*R52021/4/1738*CD4抗原分子结构引起CD4荧光强度下调2021/4/1739细胞因子分析图*过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较2021/4/1740纯化单核细胞2021/4/1741调节性T细胞检测2021/4/17422021/4/1743G3=R1*R3G4=R1*R42021/4/1744凋亡细胞测定2021/4/1745凋亡细胞测定2021/4/1746细胞凋亡检测2021/4/1747阴性的设置2021/4/1748血小板检测2021/4/1749血小板检测2021/4/1750血小板检测2021/4/1751血小板检测2021/4/1752谢谢2021/4/17539、人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低头要有勇气，抬头要有低气。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:41:21PM11、人总是珍惜为得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人乱于心，不宽余请。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/320