第八章机体免疫功能的检测技术

第八章

机体免疫功能的检测技术

第一节 免疫细胞的分离与纯化第二节 体液免疫功能的检测第三节 细胞免疫功能的检测第四节 细胞因子及其受体的检测技术第八章机体免疫功能的检测技术

第一节免疫细胞的分离与纯化一、细胞密度差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法四、细胞表面标志分离法五、其他细胞的分离和收集

根据不同细胞存在的密度差异即比重不同而分类。人外周血细胞的密度为：红细胞1.093，粒细胞1.092，单个核细胞1.075～1.090，血小板1.030～1.035。

1．自然沉降分离法

2．密度梯度离心法一、细胞密度差异分离法上层：淡黄色血浆底层：红细胞灰白层：白细胞1．自然沉降分离法（1）Ficoll密度梯度离心法（2）Percoll密度梯度离心法2．密度梯度离心法（1）Ficoll密度梯度离心法

即聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心法（ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation)Ficoll分层液的密度为：1.077±0.001

用于从外周血中分离单个核细胞用Ficoll分离外周血单个核细胞95%2000rpm20min血浆单个核细胞淋巴细胞分离液红细胞粒细胞（2）Percoll密度梯度离心法

Percoll即聚乙烯吡咯烷酮包被的硅胶混悬液的商品名，为一种无细胞毒无刺激的新型连续密度梯度分层液。

Percoll原液密度1.135

用于从单个核细胞中分离单核细胞、淋巴细胞用Percoll分离单核细胞和淋巴细胞75%98%第一节免疫细胞的分离与纯化一、细胞密度差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法四、细胞表面标志分离法五、其他细胞的分离和收集

单核/巨噬细胞具有较强的粘附能力，在37℃和Ca2+存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的表面，据此可建立许多从单个核细胞悬液中去除单核/巨噬细胞的方法，藉以获得高纯度的淋巴细胞。

1．细胞粘附力差异分离法

2．细胞吞噬能力差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法

单核/巨噬细胞具有较强的粘附能力，在37℃和Ca2+存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的表面，据此可从单个核细胞悬液中去除单核/巨噬细胞，获得高纯度的淋巴细胞。

Ｂ细胞也有一定的粘附能力，能粘附于尼龙纤维表面，可以将Ｔ细胞与Ｂ细胞分开。1．细胞粘附力差异分离法（1）粘附贴壁法：单个核细胞放在玻璃或塑料平皿中于37℃温箱静置1h，收集游离的淋巴细胞。（2）吸附柱过滤法：单个核细胞加入玻璃纤维或葡聚糖凝胶（Sephadex-G10），收集未吸附的淋巴细胞。

淋巴细胞放入尼龙纤维，可以吸附B细胞，游离细胞为T细胞。磁铁吸引法：单核/巨噬细胞具有吞噬特性，可加入直径为3um的羰基铁颗粒或乳胶颗粒，待单核/巨噬细胞充分吞噬颗粒后，再用磁场吸附或通过密度梯度离心，获得较纯的淋巴细胞。2．细胞吞噬能力差异分离法第一节免疫细胞的分离与纯化一、细胞密度差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法四、细胞表面标志分离法五、其他细胞的分离和收集三、细胞渗透压敏感差异分离法

红细胞对低渗的敏感性要高于白细胞，故可用不损伤白细胞的温和低渗液处理以除去红细胞。

1.低渗裂解法：蒸馏水

2.氯化铵处理法：0.83%氯化铵第一节免疫细胞的分离与纯化一、细胞密度差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法四、细胞表面标志分离法

五、其他细胞的分离和收集四、细胞表面标志分离法

1.E-玫瑰花环沉降法

2.亲和分离法

3.补体介导的特异性细胞毒分离法

4.免疫磁珠分离法

5.流式细胞仪分离法1.E-玫瑰花环沉降法2.亲和分离法3.补体介导的特异性细胞毒分离法

是在补体的作用下裂解与抗体结合的细胞，从而分离出不能与此抗体结合的细胞亚群。这是一种负选性分离法，简称细胞毒法。4.免疫磁珠分离法

在磁珠表面包被了特异性抗体的免疫磁珠（immunomagneticmicrobeads，IMB），可与目标细胞表面的抗原结合而与特定细胞粘附，在磁场中可以分离IMB结合细胞与IMB非结合细胞。本方法快速、特异、高效，分离效果可与FACS法媲美，对仪器的要求却低得多。

5.流式细胞仪分离法第一节免疫细胞的分离与纯化一、细胞密度差异分离法二、细胞粘附与吞噬能力差异分离法三、细胞渗透压敏感差异分离法四、细胞表面标志分离法五、其他细胞的分离和收集五、其他细胞的分离和收集

1.吞噬细胞的分离和收集

2.NK细胞和LAK前体细胞的分离1.吞噬细胞的分离和收集（1）人：组织液（斑蝥敷贴法）（2）小动物：腹腔巨噬细胞2.NK细胞和LAK前体细胞的分离单核细胞去除法:粘附法B淋巴细胞去除法:尼仑棉纤维T淋巴细胞去除法:E-玫瑰花环沉降法第一节 免疫细胞的分离与纯化第二节 体液免疫功能的检测第三节 细胞免疫功能的检测第四节 细胞因子及其受体的检测技术第八章机体免疫功能的检测技术

第二节体液免疫功能的检测一、免疫球蛋白的定量检测二、外周血B细胞数目的检测三、外周血B细胞功能的检测一、免疫球蛋白的定量检测

1.单向免疫扩散试验

2.免疫比浊法

3.ELISA单相免疫扩散试验第二节体液免疫功能的检测一、免疫球蛋白的定量检测二、外周血B细胞数目的检测三、外周血B细胞功能的检测二、外周血B细胞数目的检测1.免疫荧光技术

2.花环试验

3.流式细胞术

B细胞EA、EAC花环试验

第二节体液免疫功能的检测一、免疫球蛋白的定量检测二、外周血B细胞数目的检测三、外周血B细胞功能的检测三、外周血B细胞功能的检测1.B细胞增殖试验

2.溶血空斑试验

3.ELISPOT1.B细胞增殖试验非特异性刺激物（美洲商陆）特异性刺激物（抗原）3H-TdR掺入法MTT法形态学计数法溶血空斑试验第一节 免疫细胞的分离与纯化第二节 体液免疫功能的检测第三节 细胞免疫功能的检测

第四节 细胞因子及其受体的检测技术第八章机体免疫功能的检测技术

第三节细胞免疫功能的检测一、T细胞亚群和数目的检测二、T细胞功能的检测三、其他免疫细胞功能的检测一、T细胞亚群和数目的检测1.免疫荧光技术

2.花环试验

3.流式细胞术第三节细胞免疫功能的检测一、T细胞亚群和数目的检测二、T细胞功能的检测三、其他免疫细胞功能的检测二、T细胞功能的检测1.体外功能实验

2.体内功能实验1.体外功能实验（1）T细胞增殖试验（2）细胞毒试验（3）ELISPOT（1）T细胞增殖试验非特异性刺激物（PHA、ConA、PWM）特异性刺激物（抗原）3H-TdR掺入法MTT法形态学计数法（2）细胞毒试验（2）细胞毒试验2.体内功能实验第三节细胞免疫功能的检测一、T细胞亚群和数目的检测二、T细胞功能的检测三、其他免疫细胞功能的检测三、其他免疫细胞功能的检测1.巨噬细胞功能的检测

2.NK细胞和LAK细胞功能的检测1.巨噬细胞功能的检测2.NK细胞和LAK细胞功能的检测NK细胞靶细胞（K562）LAK细胞靶细胞（LiBr)第一节 免疫细胞的分离与纯化第二节 体液免疫功能的检测第三节 细胞免疫功能的检测第四节 细胞因子及其受体的检测技术

第八章机体免疫功能的检测技术

第四节细胞因子及其受体的检测技术一、细胞因子的检测方法二、细胞因子受体的检测方法一、细胞因子的检测方法

1.生物活性检测技术（依赖性细胞株、功能测定等）

2.免疫学检测技术（ELISA、RIA）

3.分子生物学技术（分子杂交技术、PCR）

4.