基因工程的基本操作程序修改

1.2基因工程的基本操作程序补充：基因的结构（1）原核生物基因结构编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游编码蛋白质调控遗传信息的表达（调控程序）启动子终止子…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………...G…T‥…......TACACGTGCATCAAT………...C编码区非编码区非编码区启动子终止子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGUUA

启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。

RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.

终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质的序列。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。编码区非编码区原核细胞的基因结构②是调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。（也就是启动子）（2）真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子

不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：

外显子：

真核细胞的一个基因的编码区转录出前体mRNA，需把其中的内含子切除，外显子拼接成成熟mRNA。真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码真核基因长1.2基因工程的基本操作程序二.基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定一.目的基因的获取基本操作的四个步骤一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因2、获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成生物抗逆性相关基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因等

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库

基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）1、基因文库（一）从基因文库中直接获取一、目的基因的获取限制酶酶基因组组DNA基因重重组转化细细菌体外包包装1)基因组组文库库(Genomiclibrary)是指将将某种种生物物体的的全部基基因组组DNA，用限制性性内切切酶或机械械力量量切割成一定定长度度范围围的DNA片段段，再再与合合适的的载体在体外外重组组后，，导入入受体菌菌的群群体中中储存存，这个个群体体就称称为该该生物物基因组组文库库。其目的的是分分离有有用的的目的的基因因和保保存某某种生生物的的全部部基因因。cDNA(互补DNA)：是用某某种生生物发发育的的某个个时期期的mRNA反转录录产生的的多种种互补DNA（也叫叫cDNA）片段，与载体连连接后储存存在一一个受受体菌菌群中中，这这个受受体菌菌群就就叫做做这种种生物物的cDNA文库2)cDNA文库(cDNAlibrary)基因重重组反转录录酶mRNAcDNA提取某种种生物的的全部DNA一定大小小的DNA片段导入受体体菌中储储存用适当的限制酶切割将DNA片段与载体连接基因组文文库直接分离离法(鸟枪法)多用于原原核生物物2、基因组文文库的建建立方法法某种生物物的单链链mRNA单链互补补DNA双链cDNA片段导入受体体菌中储储存cDNA文库反（逆））转录酶酶DNA聚合酶3、cDNA文库的的构建-----反转转录法多用于真核生物物文库类型

cDNA文库基因组文库

文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）基因多少物种间的基因交流小大无有无有某种生物物的部分分基因某种生物物的全部部基因可以部分基因因可以基因组文文库和部部分基因因组文库库(cDNA文库)比较基因组文文库与部部分基因因文库的的关系怎样从基基因文库库中得到到我们所所需的目目的基因因呢?依据：目目的基因因的有关关信息。。如：根据据基因的的核苷酸酸序列基因的功功能基因在染染色体上上的位置置基因的转转录产物物mRNA基因翻译译产物蛋蛋白质等等特性4、从基因文文库中得得到目的的基因的的方法寻根问底底——为什么要要构建基基因文库库？直接接从含有有目的基基因的生生物体内内提取不不行吗？？提示：构构建基因因文库是是获取目目的基因因的方法法之一，，并不是是惟一的方方式。如果所所需要的的目的基基因序列已知知，就可以以通过PCR方式从含有该该基因的的生物的的DNA中，直接接获得，，也可以以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，，不一定定要构建建基因文文库。但但如果所所需要的的目的基基因的序列完全全不知，或只知知道目的的基因序列的一一段，或想从从一种生生物体内内获得许多多基因，或者想想知道这这种生物物与另一一种生物物之间有多少基基因不同同，或者想想知道一一种生物物在个体体发育的的不同阶段段表达的的基因有有什么不不同，或者想想得到一一种生物物的全基基因组序序列，往往往就需需要构建建基因文文库。18（二）利利用PCR扩增目的的基因(二)利用PCR技技术扩增增(二)利用PCR技技术扩增增①概念念：PCR全称为_______________，是一项项在生物____复制___________的核酸合合成技术术③条件：：_______________________、_______________、、___________(做启启动子)、___________。②原理：：__________④方式：：以_____方式扩增增，即____（n为扩增循循环的次数数）⑤结果：：聚合酶链链式反应应体外特定DNA片段DNA复制已知基因因的核苷苷酸序列列四种脱氧氧核苷酸酸一对引物物热稳定DNA聚合酶（（Taq酶）指数2n使目的基基因的片片段在短短时间内内成百万万倍地扩扩增前提条件件⑥过程：：a、DNA变性（90℃-96℃℃）：：双双链链DNA模板板在热热作作用用下下，，_____断裂裂，，形形成成___________b、、退退火火（复复性性55℃℃-65℃℃））：：系系统统温温度度降降低低，，引物物与DNA模板结结合，形形成局部部________。。c、延伸伸（70℃℃-75℃）：：在DNA聚聚合酶的作用用下，从从引物的的5′端→→3′端端延伸，合合成与模模板互补补的________。氢键单链DNA双链DNA链DNA合成方向向总是从从子链的的5′端→→3′端端延伸PCR技术扩增增与DNA复制的比比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补补配对四种脱氧氧核苷酸酸模板、能能量、酶酶DNA在高温下下变性解解旋解旋酶催催化体外复制制细胞核内内热稳定DNA聚合酶细胞内的的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个个DNA分子（三）、人工合合成法：：基因较小，核苷酸酸序列已知知，可以利利用DNA合成仪人工合成成反转录法目的基因因的信使使RNA目的基因因化学合成成法肽链氨基基酸序列列信使RNA序列基因的核核苷酸序序列目的基因因合成逆转录人工合成成法推测推测单链DNA合成1、下列属属于获取取目的基基因的方方法的是是()①利用mRNA反转录录形成②②从基因因组文库库中提取取③从受体细细胞中提提取④④利用PCR技技术⑤利用DNA转录录⑥⑥人人工合成成A.①②②③⑤B.①②⑤⑤⑥C.①②②③④D.①①②④⑥⑥2、有关基基因工程程的叙述述正确的的是（（））A、限制制酶只在在获得目目的基因因时才用用B、重组组质粒的的形成在在细胞内内完成C、质粒粒都可作作为运载载体D、蛋白白质的结结构可为为合成目目的基因因提供资资料D1.作用：二.基因表达达载体的的构建———核心心IMN2.组成：①使目的基基因在受受体细胞胞中稳定定存在并并遗传给给子代。②同时使使目的基基因能表表达和发发挥作用用。(3)终止子子：(4)标记基基因：：(2)启动子子：(1)目的基基因。。（5）复制制原点点：不同受受体细细胞，，目的的基因因导入入受体体细胞胞的方方法不不同，，基因因表达达载体体的构构建有有所差差异。。是RNA聚合酶酶识别别和结结合部部位。。是使转转录在在需要要的地地方停停止。。是鉴别别受体体细胞胞中是是否含含有目目的基基因从而将将含有有目的的基因因的细细胞筛筛选出出来。。是复制制的起起点。。①载体与表达载载体的区别别：二二者都都有标标记基基因和和复制制原点点两部部分DNA片段。。表达载载体在在载体体基础础上增增加了了目的的基因因、启启动子子、终终止子子三部部分结结构②用到的的工具具酶：：既用到到限制制酶切切割载载体，，又用用到DNA连接酶酶将目目的基基因和和载体体拼接接，两两种酶酶作用用的化化学键键都是是磷酸酸二酯酯键③启动子子、终终止子子对于目目的基基因表表达必必不可可少④目的基基因不不能单单独进进入受受体细细胞，，必需以以表达达载体体的方方式携携带进进去。。注意寻根问问底：：将目目的基基因直直接导导入受受体细细胞不不是更更简便便吗？？如果果这么么做，，结果果会怎怎样？？提示：有人人采用总DNA注射法进行行遗传转化化，即将一一个生物中中的总DNA提取出来，，通过注射射或花粉管管通道法导导入受体植植物，没有有进行表达达载体的构构建，这种种方法针对对性差，完完全靠运气气，也无法法确定什么么基因导入入了受体植植物。此法法目前争议议颇多，严格来讲讲不算基基因工程程。思考与探探究：1.作为基因因工程表表达载体体，只需需含有目目的基因因就可以以完成任任务吗？？为什么么？不可以。。因为目目的基因因在表达达载体中中得到表表达并发发挥作用用，还需需要有其其他控制制元件，，如启动动子、终终止子和和标记基基因等。。必须构构建上述述元件的的主要理理由是：：（1）生物物之间进进行基因因交流，，只有使使用受体体生物自自身基因因的启动动子才能能比较有有利于基基因的表表达；（2）通过过cDNA文库库获得的的目的基基因没有有启动子子，只将将编码序序列导入入受体生生物中无无法转录录；（3）目的的基因是是否导入入受体生生物中需需要有筛筛选标记记；（4）为了了增强目目的基因因的表达达水平，，往往还还要增加加一些其其他调控控元件，，如增强强子等；；（5）有时时需要确确定目的的基因表表达的产产物存在在于细胞胞的什么么部位，，往往要要加上可可以标识识存在部部位的基基因（或或做成目目的基因因与标识识基因的的融合基基因），，如绿色色荧光蛋蛋白基因因等。3、将目的的基因导导入受体体细胞转化——方法将目的基基因导入入植物细胞胞将目的基基因导入入动物细胞胞将目的基基因导入入微生物细细胞农杆菌转转化法基因枪法法花粉管通通道法——显微注射射法——感受态细细胞法目的基因因进入_________内，并且且在受体体细胞内内维持_____和_____的过程受体细胞胞稳定表达常用的受受体细胞胞：有大肠杆杆菌、枯枯草杆菌菌、土壤壤农杆菌菌、酵母母菌和动动植物细细胞等。。1、将目的的基因导导入植物物细胞的的方法：：（1）农杆菌菌转化法法①农杆菌菌特点：：易感染双双子叶植植物和裸裸子植物物，对大大多数单单子叶植植物没有有感染能能力②原理：：Ti质粒上的T-DNA可以转移移到受体体细胞，，并整合到受受体细胞胞染色体体的DNA上。双子叶植植物、祼子植物物适用生物物?目的基因因Ti质粒上的的T－DNA插入植物细胞胞农杆菌染色体DNA上维持稳定定和表达达并整合到到导入感染同时T-DNA导入③过程：：④优点：比较经济济和有效效思考与探探究：2.根据农杆杆菌可将将目的基基因导入入双子叶叶植物的的机理,你能分析析出不能能导入单单子叶植植物的原原因吗?若将一个抗病病基因导入小小麦中,理论上讲你应应该怎样做?①要选择合适的的农杆菌菌株株，因为不是是所有的农杆杆菌菌株都可可以侵染单子子叶植物；②要加趋化和诱诱导的物质，，一般为乙酰酰丁香酮等，，目的是使农农杆菌向植物物组织的受伤伤部位靠拢（（趋化性）和和激活农杆菌菌的Vir区区（诱导）的的基因，使T-DNA转转移并插入到到染色体DNA上。37（2）基因枪法：利用压缩气体体产生的动力力，将包裹裹在金属粒表表面的表达载载体DNA打入受体细胞胞中，使目的的基因与其整整合并表达的的方法①操作方法：：②金属粒：将目的基因导导入单子叶植植物细胞钨粉粒子和金金粉粒子，粒子的直径一一般在0.6～4um。④适用：单子叶叶植物③缺点：成本较高（3）花粉管通道法法：将目的基因导导入植物细胞胞①操作方法：：②特点：在植物受粉后后，花粉形成成花粉管还末愈合前前期，剪去柱柱头，然后，滴入DNA（含目的基因因）使目的基基因借助花粉管通通道进入受体体细胞十分简便经济济③例：转基因抗虫棉棉2.将目的基因导导入动物细胞胞显微注射技术术提纯含目的基基因的表达载体体取出受精卵显微注射受精卵移植入输卵管或子宫发育成具新性状的动物①方法：②程序：培养成早期胚胎①原核生物特特点：繁殖快、多为为单细胞、遗遗传物质相对对较少，故早早期常作为受受体细胞。大肠杆菌细胞胞感受态细胞用Ca2+处理重组表达载体体DNA溶于缓冲液混合转入②方法：常用菌：大肠杆菌3.将目的基因导导入微生物细细胞通过标记基因因，进行筛选选和检测导入过程完成成后，全部受受体细胞都能能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重重组DNA分子的受体细细胞很少。所以要对受体体细胞作怎样样的处理？对受体细胞中中是否导入了了目的基因进进行检测怎样进行检测测？4、目的基因的的检测与鉴定定——检查是否成功功检测鉴定——①检测转基因因生物染色体的DNA上是否否插入②检测测目的③检测测目的的基因因是否翻翻译成成蛋白白质抗虫鉴鉴定、、抗病病鉴定定、活活性鉴鉴定等等方法——方法——方法——DNA分子杂杂交分子杂杂交抗原抗抗体杂杂交DNA分子杂杂交示示意图图采用一一定的的技术术手段段，将将两种种生物物的DNA分子的的单链链放在在一起起，如如果这这两个个单链链具有有互补补的碱碱基序序列，，那么么，互互补的的碱基基序列列就会会结合合在一一起，，形成成杂合合双链链区；；在没没有互互补碱碱基序序列的的部位位，仍仍然是是两条条游离离的单单链。。碱基互互补配配对原理：：1.检测转基因因生物的DNA探针15N15N14N14N（1）检检测转转基因因生物物染色色体的的DNA上上是否否插入入了目目的基基因基因探探针：：放射性性同位位素等等标记记含有有目的的基因因的DNA片段段方法——DNA分子杂杂交技技术方法——分子杂杂交技技术（2）检测测目的的基因因是否转转录出出了mRNA探针15N15N转基因因生物物的mRNA14N提取（3）检测测目的的基因因是否否翻译译成蛋蛋白质质方法———苏云金杆菌Bt毒素蛋蛋白将Bt毒蛋白白注射射小鼠鼠体内内从小鼠鼠血管管抽出出血液液分离离出抗抗Bt毒素的的抗体体抗体Bt毒素蛋蛋白（（抗原原）出现杂杂交带带脱分化化组织培培养证明：：提取蛋蛋白质质与Bt毒素蛋蛋白质质一样样抗原-抗体杂杂交例：用用棉铃铃饲喂喂棉铃铃虫，，如虫虫吃后后不出出现中中毒症症状，，说明明未摄摄入目目的基基因或或摄入入目的的基因因未表表达。。如虫虫吃后后中毒毒死亡亡，则则说明明摄入入了抗抗虫基基因并并得到到表达达。2.鉴定———个体生物物学水平平的鉴定定（1）多细胞胞个体抗虫、抗抗病结种种实验，，活性比比较实验验不能，受受体细胞胞必须表表现出特特定的性性状，才才能说明明目的基基因完成成了表达。受体细胞胞摄入DNA分分子后就就说明目目的基因因完成了表表达吗？？若不能表表达，要要对抗虫虫基因再再进行修饰。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物细菌的检检测，将将每个受体细胞胞单独培培养形成菌落落，检测菌菌落中是是否有目目的基因因的表达达产物。。淘汰无无表达产产物的菌菌落，保保留有表表达产物物的进一一步培养养、研究究。（2）单细胞胞生物3.利用大肠肠杆菌可可以生产产出人的的胰岛素素，联系系前面有有关细胞胞器功能能的知识识，结合合基因工工程操作作程序的的基本思思路，思思考一下下，若要要生产人人的糖蛋蛋白，可可以用大大肠杆菌菌吗？有些蛋白白质肽链链上有共共价结合合的糖链链，这些些糖链是是在内质质网和高高尔基复复合体上上加工完完成的，，内质网网和高尔尔基复合合体存在在于真核核细胞中中，大肠肠杆菌不不存在这这两种细细胞器，，因此，，在大肠肠杆菌中中生产这这种糖蛋蛋白是不不可能的的。思考与探探究：53（1）从小鼠鼠中克隆隆出β-珠蛋白白基因的的编码序序列（cDNA）（2）将将cDNA前接接上在大大肠杆菌菌中可以以适用的的启动子子和终止子，另外加加上抗四四环素的的基因，，构建成成一个表表达载体体。（3）将表达达载体导导入无四四环素抗抗性的大大肠杆菌菌中，然然后在含含有四环环素的培培养基上上培养大大肠杆菌菌。如果果表达载载体未进进