XXXX年本科实验四 重组质粒DNA提取双酶切鉴定

质粒DNA的制备

限制性内切酶切割重组质粒朱文博中山医学院基因克隆定义：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。

基因工程定义：实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为基因工程，又称重组DNA技术。基因克隆示意图分、切接转筛

基因载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。

实验内容2.限制性内切酶的酶切鉴定(P82)3.定性鉴定:DNA的琼脂糖凝胶电泳4.定量检测：DNA的紫外分光光度法测定(P39)1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法)实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用

;掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切酶一.质粒DNA的提取1关于质粒的概念a.什么是质粒（plasmid）？b.质粒的本质是什么？c.质粒有哪些构型？c.质粒有哪些特点？d.质粒的用途有哪些？81.1质粒的定义

质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。

9(1)超螺旋DNA(supercoiledDNA,SCDNA)1.2质粒的三种构型10(2)开环环DNA(opencircularDNA,OCDNA)如果果两两条条链链中中有有一一条条的的一一处处或或多多处处断断裂裂，，分分子子就就能能发发生生旋旋转转而而消消除除链链的的张张力力，，形形成成松松弛弛型型的的环环状状分分子子。。11(3)线状状DNA(linearDNA,LDNA):如果果两两条条链链均均断断开开，，即即为为线线状状DNA。电泳泳时时，，三三者者泳泳动动速速度度大大小小关关系系（（？？？？？？））12最快快中最慢慢1.3质粒粒DNA的基基本本特特征征：：(1)自主主复复制制性性：能能独独立立于于染染色色体体DNA外自自主主复复制制；；(2)可扩扩增增性性：严严紧紧型型复复制制-复制制1-5个拷拷贝贝松弛弛型型复复制制-复制制数数十十个个拷拷贝贝；；(3)可转转移移性性：通通过过细细菌菌结结合合作作用用从从一一个个宿宿主主细细胞胞转转移移到到另另一一个个宿宿主主细细胞胞；；(4)不相相容容性性：具具有有相相似似复复制制子子结结构构特特征征的的两两种种不不同同质质粒粒不不能能稳稳定定地地存存在在于于同同一一受受体体细细胞胞内内。。141.4理想想的的克克隆隆载载体体：：(1)分子子质质量量小小、、多多拷拷贝贝、、松松弛弛控控制制型型；(2)具有有多多种种常常用用的的限限制制酶酶的的单单切切点点；(3)能插插入入较较大大的的外外源源DNA片段段；(4)具有有容容易易操操作作的的检检测测表表型型。15151.4提取取质质粒粒DNA的目目的的与与意意义义：：基因因载载体体/基因因克克隆隆/基因因工工程程2.1提取取质质粒粒DNA的常常规规方方法法(1)SDS碱裂裂解解法法(2)煮沸沸法法(3)highpureplasmidisolationkit等。。但原原理理相相似似，，都都是是利利用用宿宿主主染色色体体DNA和质质粒粒DNA的差异来分离的的：★宿宿主菌染染色体DNA通常比质质粒DNA要大得多多★纯纯化分离离的宿主主菌DNA多为线性性分子，，而质粒粒DNA呈闭合环环的形式式。2提取大肠肠杆菌质质粒DNA的

方法法和原则则2.2分离纯化化质粒DNA的主要步步骤(1)培养细菌菌使质粒粒扩增（（DNA的扩增与与选择））(2)细菌的收收集与裂裂解收集方法法：高速速离心的的方法裂解细菌菌方法：：去污剂剂法、有有机溶剂剂法、碱变性法法、沸水热裂法、、溶菌酶酶法、超超声处理理法等。。根据质粒粒的大小小、宿主主菌菌株株及裂解解后的纯化方法法等因素素综合后后加以选选择。(3)质粒DNA的纯化常用的方方法有：：超速离离心、层层析法、、聚乙二二醇沉淀淀法等所有纯化化方法都都是利用用了质粒粒DNA相对较小及共价价闭合环环状的性性质。2.3核酸分离离纯化的的总原则则：(1)保证核酸酸一级结结构完整整(2)排除其他他分子的的污染（（蛋白质质、脂类类、糖、有机溶剂剂、金属属离子、、其他DNA、RNA等）3.SDS-碱裂解法法提取Puc119-U6重组质粒粒DNA3.1实验原理理：高碱细菌的细细胞壁破破裂，内内容物释释放①染色体体DNA断裂成不不同长度度的线性性双链DNA；②线性双双链DNA片段中的的氢键断断裂，双双链解离离变性。。①质粒DNA不发生断断裂，保保持双链链闭合环环状；②双链DNA并不完全全分离。。高酸中和至中性变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化RNA酶消化除除去RNA，并用酚酚抽提法法除去残残留的蛋蛋白质3.2主要试剂剂及作用用溶液Ⅰ：：由葡萄萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓缓冲)①葡萄糖的作用是是增加溶溶液的粘粘度,减减少抽提提过程中中的机机械剪切作用用,防止止破坏质质粒.(保护作用用)②EDTA的作用是是络合掉掉镁等二二价金属属离子,防止止DNA酶对质粒粒分子的的降解作作用。（（保护作作用）③Tris•HCl能使溶菌菌液维持持溶菌作作用的最最适PH范围（缓缓冲作用用）21溶液II：由SDS（（十二烷基基硫酸钠钠）与NaOH组成(裂解、变变性)①SDS的作用是是解聚核核蛋白并并与蛋白白质分子子结合使使之变性（裂裂解细胞胞和蛋白白质变性性作用））②NaOH（PH>12）的作用用是破坏坏氢键，，使DNA分子变性性（DNA变性作用用）22溶液III：：HAC(乙酸)和KAC(乙酸钾)组成的高高盐溶液液(复性，分分离)①HAC溶液能中和溶溶液Ⅱ的的碱性，，使染色色体DNA变性而发发生缠绕绕，并使使质粒DNA复性。②KAC会与SDS形成溶解解度很低低的盐，，并与蛋蛋白质形形成沉淀而除除去；溶溶液中的的DNA也会与蛋蛋白质-SDS复合物缠缠绕成大大分子而而与小分分子质粒粒DNA分离。3.3实

验步步骤加1.4ml培养物于于EP管，12000rpm×1min，去上清清，再加1.4ml培养物至至原管，，12000rpm×1min，去上清清加入冰的的200µµl溶液I，剧烈振荡荡EP管，室温温放置3min加入200µµl溶液II，快速颠颠倒数次次，冰浴浴3min（不要振振荡！））加入150µµl冰溶液III，温和振振荡10s，冰浴5min，12000rpm×5min转移上清清500µµl到新EP管，加入入等体积积500µµl的酚与氯仿/异戊醇的的混合物物（1:1混合），充分颠颠倒混匀匀，4℃12000rpm××5min400µl上层水相相转移到到新的EP管，加入等体体积400µµl氯仿/异戊醇，颠倒混混匀，4℃12000rpm5min400µl上层水相相转移到到新的EP管，加入2倍体积800µµl无水乙醇醇，颠倒混混匀，-20℃℃冰箱中放放置15min，4℃12000rpm10min弃上清，，沉淀中中加1ml70%乙醇，4℃12000rpm××5min去上清，，管平放放室温静静置5-10min，20µµlTE溶解DNA注意事项项：1、加样样枪正确确使用；；2、标记记自己所所提取的的质粒类类型；3、废液液倒在水水池中，，枪头扔扔到垃圾圾桶中；；4、加不不同溶液液要换枪枪头；5、离心心前把管管擦干；；6、转移移上清时时不要吸吸到沉淀淀；7、吸取取酚时枪枪头伸到到下层溶溶液中，，注意不不要沾到到皮肤；8、每人最终终得到20ul质粒DNA，其中10ul用于酶切和电泳泳，其余余DNA储存于-20℃℃用于电泳泳对照！二、限制制性内切切酶切割割重组质质粒1关于限制制性核酸酸内切酶酶（（restrictionendonuclease）1.1定义能在特特异位位点（（酶切切位点点）上上催化化双链链DNA分子的的断裂裂,产生相相应的的限制制性DNA片段。。主要存存在于于细菌菌体内内。切割不不同来来源的的DNA分子将将产生生特征征性限限制性性酶切切图谱谱，具具有重重大应应用价价值（（“分子手手术刀刀”）。261.3作用与甲基基化酶酶共同同构成成细菌菌的限限制修修饰系系统，，限制制外源源DNA，保护自自身DNA。1.2分类Ⅰ、ⅡⅡ、ⅢⅢ（基因因工程程技术术中常常用ⅡⅡ型））第一个个字母母取自自产生生该酶酶的细细菌属属名，，用大大写；；第二、、第三三个字字母是是该细细菌的的种名名，用用小写写；第四个个字母母代表表株；；用罗马马数字字表示示发现现的先先后次次序。。1.4命名HindⅢ属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜嗜血杆杆菌d株的第第三种种酶2BamHI、HindⅢⅢ酶切质质粒及及鉴定定2.1实验原原理：：利用限限制性性内切切酶特特异的的识别别DNA特异的的核苷苷酸序序列，，并切切割DNA,产生一一定长长度的的DNA片段，，通过过电泳泳对酶酶切前前后产产物分分析可可以鉴鉴别目目的基基因（（重组组质