发酵豆粕品质检测方法适用性

梁运祥华中农业大学生命科学技术学院农业微生物学国家重点实验室发酵豆粕品质检测方法适应性

发酵豆粕价值发酵豆粕：优质的尤其适用于幼小动物的蛋白质饲料。加工过程：以豆粕为原料，通过多菌种发酵转化而来。价值实现：抗营养因子消除蛋白质“预消化”微生物代谢产物微生物菌体益生作用品质检测:除常规营养等检测外，围绕上述作用开展针对性检测。品质检测结果与动物饲喂结果一致性要求。发酵豆粕作为一种优质的饲料蛋白质，养殖效果得到了广泛的认可和大量应用。发酵豆粕品质鉴别及分析方法初步建立，仍不完善，方法适用性和结果准确分析仍需要进一步明确。目录1、原料组成分析2、大豆抗原的分解3、大豆低聚糖检测4、大豆多肽分析5、其他检测指标1、发酵豆粕的原料构成分析受成本和利益的驱使，少数厂家在发酵豆粕生产中添加低值低成本的其它原料，严重下降了发酵豆粕的品质。通过对大豆异黄酮和氨基酸的含量分析，能够判断发酵豆粕中是否添加有非豆粕成分和粗略添加比例。1.1豆粕发酵过程中影响大豆异黄酮的因素物理因素影响（加工工艺的影响）粉碎、干燥等工艺过程的影响。粉碎也是因为温度而起作用。化学因素影响（pH的影响）工艺中不添加化学物质，主要是pH的影响。生物因素影响（发酵菌株的影响）微生物及其酶的作用1.1.1加工工艺（温度）对发酵豆粕大豆异黄酮的影响110℃热处理对大豆异黄酮的影响0h1h3h5h7h9h12h14h16h0.970.950.960.980.950.990.971.031.00

加热处理不会破坏大豆异黄酮。1.1.2微生物发酵菌株对发酵豆粕大豆异黄酮的影响菌株对大豆异黄酮的影响CK枯草地衣短小乳杆菌1乳酸菌2乳酸菌30.971.151.081.0830.990.980.94100%98102979898101

酵母菌1酵母菌2混菌发酵黑曲霉根霉毛霉1.000.991.131.231.031.059998100979997

微生物发酵菌株不会破坏大豆异黄酮1.1.3pH的影响

发酵豆粕的酸度不会破坏大豆异黄酮。CK3.54.04.55.05.56.00.970.940.980.950.990.970.99不同pH对大豆异黄酮的影响

异黄酮检测结结果：样品中存在非豆粕成分氨基酸的对比

豆粕发酵后，微生物的生物量在100-200亿每克，100克产品中微生物菌体蛋白质含量为0.5-1克，发酵后不会显著改变原有氨基酸的组成，发酵产品氨基酸对豆粕氨基酸的增加值与粗蛋白的增加值相当，变异幅度在10%左右，可以根据这一规律判断发酵豆粕的原料组成。氨基酸含量分析：

氨基酸含量通过日立835-50氨基酸自动检测仪来测定。

氨基酸种类发酵前豆粕（％）发酵后豆粕（％）比值苏氨酸(Thr)1.9452.2371.15

丝氨酸(Ser)

2.1532.8081.30

谷氨酸(Glu)7.2319.5341.32

甘氨酸(Gly)2.2872.7021.18

丙氨酸(Ala)2.3502.6931.15

缬氨酸(Val)2.5223.1441.20

蛋氨酸(Met)0.5680.6701.18

异亮氨酸(Ile)2.3562.5431.08续表：氨基酸种类发酵前豆粕（％）发酵后豆粕（％）比值亮氨酸(Leu)4.0984.4591.09苯丙氨酸(Phe)2.3102.7991.20赖氨酸(Lys)2.9103.9781.36总氨基酸含量44.77055.1151.23粗蛋白46561.22※发酵后粗蛋白由46%提高到56%，增加22%，各单个氨基酸含量较发酵前都有相应增加；总氨基酸较发酵前提高了23％。

2、大豆抗原的分解原理：利用7S与11S蛋白抗原的SDS电泳图谱直接展示。根据电泳图谱的颜色及大小定性判断抗原的分解程度。

SDS电泳展示的是溶解的蛋白质，因此影响蛋白质溶解的工艺过程，如高温干燥工艺，发酵添加物，人工酸化以及使用陈化豆粕都将影响蛋白质溶解率，使电泳图变浅变小，出现分解好的假性结果。

目前这一方法存在较大局限性，不易作为品质分析指标。7S与11S球蛋白的SDS电泳

从图中可以看出：CK中存在7S球蛋白的三个亚基与11S球蛋白两个亚基。Ck为发酵前豆粕中提取的球蛋白。M为低分子蛋白质标准，分子量为14.4KD－97.4KD。2.1发酵豆粕酸溶性蛋白（小肽）及其在碱性条件下的变化将样品在碱性下（pH8.8）提蛋白，离心所得上清。原豆粕编号（Y）在pH调至6.85，发酵豆粕编号（7）pH调至6.05时开始出现明显沉淀。原豆粕编号（Y）和发酵豆粕编号（7）pH调至4.5时酸溶性蛋白（小肽）沉淀状况。2.2陈化豆粕与大豆分离蛋白的SDS电泳结果

样品浓度mg/ml2010年豆粕(A)1.832012年豆粕(B)2.38

大豆分离蛋白(C)2.66随着豆粕存放时间延长，碱溶性蛋白质下降，

ABC随着存放时间的延长，肽链的空间结构有紧缩的趋势2.2添加金属盐的影响低较低中高CKA盐2.2添加金属盐的影响B盐和C盐注：1、2、3和4分别为B盐的低、较低、中、高剂量，5、6、7、8分别为C盐的低、较低、中、高剂量。2.3加热处理豆粕的SDS电泳结果0h、1h、3h、5h、9h、15h为原豆粕经115℃处理时间2.4酸处理豆粕的SDS电泳结果方法：HCl配成0%、1%、2%、3%、4%、5%浓度，按50%的量添加到原豆粕中，35℃烘干。0%、1%、2%、3%、4%、5%为加缓冲液提取，但不调pH0%’、1%’、2%’、3%’、4%’、5%’为加缓冲液提取，调pH8.8

不同发酵豆粕样品碱性可溶性蛋白浓度

样品编号蛋白浓度（mg/ml）

CK2.42A2.42C1.85Y22.23S11.7523.8573.66

理论上碱溶性蛋白浓度在25mg/ml,实际上在1.75—3.85mg/ml之间，提取蛋白质仅占蛋白质7%—15%。不同发酵豆粕绝对上样量相同电泳图浓缩胶浓度5%，分离胶浓度15%72S1Y2CACK

结合上面分析结果，不同产品虽然电泳结果存在较大差异，但它不能真正说明谁优谁劣。

综合来看，影响蛋白质肽链空间结构（或松散或紧密），电荷多少的条件，如存放时间、干燥温度、干燥时间、盐种类、盐浓度等都影响电泳结果，且经多重加工后，碱溶性提取蛋白质不到全部蛋白质的20%。因此，电泳胶的结果不能科学客观反映蛋白质降解状况。因此，SDS电泳结果在直观认识大豆蛋白质特点、组成时是有意义的，在当前技术条件下，不能作为发酵豆粕质量的判别依据。3、大豆低聚糖检测在豆粕中低聚糖主要为水苏糖、棉籽糖和蔗糖。它们在干基含量分别为4％、2％、5％。

棉籽糖是半乳糖以α（1，6）糖苷键与葡萄糖基连接。

水苏糖是半乳糖以α（1，6）糖苷键与棉籽糖中半乳糖基连接。

液相色谱可以进行准确定量，一般不具备检测条件；薄层层析简单，直观，企业可进行分析。

3.1大豆低聚糖标准品棉籽糖与水苏糖的液相色谱图保留时间：棉籽糖7.462min

水苏糖12.002min发酵前原豆粕中棉籽糖与水苏糖的液相色谱图保留时间：棉籽糖7.447min

水苏糖11.917min峰高：水苏糖2.10cm水苏糖棉籽糖3.2薄层层析

4.大豆多肽大豆多肽定义：以大豆，豆粕或大豆蛋白为主要原料，用酶解法或微生物发酵法生产的，分子量分布在10000Da以下的肽称为大豆多肽。能够指示豆粕蛋白质的水解状态。4.1大豆多肽分析方法

由于精确分析难度大，一般以三氯乙酸-可溶性氮指数(TCA-SNI)和水解度(DH)表示。对蛋白质水解由于存在内切酶和外切酶的差距，上述方法不能完全准确预示一个混合蛋白质或饲料原料蛋白质水解状况。4.1.1三氯乙酸-可溶性氮指数(TCA-SNI)的测定将发酵豆粕水溶液与浓度为10%的三氯乙酸以1:1比例混合，4500r/min离心10min后取上清液用凯氏定氮法测定。4.1.2水解度(DH)的测定蛋白质水解度(DH)的定义为水解过程中打开的肽键占蛋白质肽键总数的百分比，采用甲醛法测定。温度对DH和TCA-SNI的影响

大豆蛋白质肽链分子量主要分布在40000-70000之间，平均约为55000。以此推算，氨基酸残基数约为458（氨基酸平均分子量取120），有457个肽键，若水解度为10%，即有45个肽键被分解，产生46个分子，其平均分子量为55000/46=1195，其水溶性指数理论上是100%，与上述40%相差甚远。4.1.3酸溶性氮指数法1、发酵豆粕水溶（蒸馏水，一般按1：5），调至pH=4.5，并于12000rpm离心10min（或过滤），取上清检测。2、采用凯式定氮法检测上清中氮的含量（a）：3、直接取上清液（不消化）检测无机氮（主要是铵态氮）（b）；4、样品中多肽量的计算多肽量=（a-b）*蛋白质换算系数4.2发酵豆粕多肽含量液体酶解条件下，在底物（大豆蛋白）和蛋白酶都过量情况下，大豆多肽含量最高在6.5%-7.0%。固体发酵由于受到水分限制，发酵豆粕产品的多肽含量理论上不会超过10%。有些产品超过10%，是非蛋白氮较高，或者加入氨基酸生产废液废渣。底物浓度与多肽含量的关系5、胰蛋白酶抑制剂的测定（GB/T21498-2008）

原理：胰蛋白酶抑制剂能够和胰蛋白酶结合，通过测定底物（BAPA）被未结合的胰蛋白酶酶解生成的产物――对硝基苯胺溶液的吸光度，然后以它和未加抑制剂的标准吸光度之差来表示被抑制的胰蛋白酶活性。6、植酸含量的测定

原理：用分光光度法测定用过量的Fe3+与植酸反应后的上清液中剩余Fe3+，从而间接测定植酸含量。、7、脂肪氧化酶活性的测定原理：利用豆粕中的脂肪氧化酶与不饱和脂肪酸——亚油酸反应，测定反应物的吸光值大小来表示酶活的大小。、

9、

脲酶活性的测定

原理：将粉碎的豆粕与中性尿素缓冲溶液混合,在30℃保持30min,尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。用过量盐酸中和所产生的氨,再用氢氧化钠标准溶液回滴。

10、致甲状腺肿素含量的测定原理：在有水介质存在的情况下，大豆中的硫代葡萄糖苷与同时存在硫代葡萄糖苷酶发生水解，在pH＝7的条件下，主要生成异硫氰酸酯（ITC），带羟基的ITC极不稳定，在极性溶液中自动环化成恶唑硫酮（OZT），在紫外区245nm处具有特征吸收峰，可灵敏地检测到。11、大豆凝血素的测定原