2.生物大分子分离纯化技术2

第二章

生物大分子分离纯化技术12.2.2微过滤

微过滤(microfiltration)是透析技术的进一步发展，它以多孔薄膜为过滤介质，让样品溶液通过多孔膜(超滤膜)过滤。它可以用于滤除小颗粒，使混浊液澄清，也可以收集纯的沉淀供进一步分析。21.深层滤器(DepthFilter)：由纸、棉花或玻璃纤维制成。过滤时将颗粒保留在滤器的深层之内，滤器有较大的截面积和相当的深度，因而具有较大的容量。这种过滤法具有较快的流速。缺点：滤层的孔径不一，变化范围较宽；基质具有广泛的吸附作用，因而造成样品的损失；基质破损碎片往往会造成样品的污染。微过滤的类型32.滤膜滤器(ScreenFilter)

滤膜滤器的关键是超滤膜(MicrofiltrationMembrane)，它的孔径均一，不能通过滤膜的颗粒截留在膜的表面。为了保证一定的流速，必须减压或加压。这类滤膜具有疏水性，所以在制造时常用表面活性剂处理，处理之后还要将表面活性剂清洗干净，以防止使用时对样品的污染。现在已有亲水性膜产品。微过滤的类型在线式可换膜过滤器正压桶式滤器针式样品过滤器滤膜4微过滤技术的应用

(1)溶液的澄清。生物样品溶液或细胞溶液常常由于低溶解度或变性而混浊，在用分光光度或荧光法测定时需要进行过滤，以加大溶液的透光性能。通过这种过滤方法也可用于滤除有些溶液中可能存在的细菌或微生物污染物。

(2)生化分析中常需要收集微量的沉淀物．对于放射性沉淀物的收集超滤膜过滤法非常理想。

(3)细菌细胞的收集。虽然一般用离心法收集细胞，但若用超过滤法收集，则效率可提高近十倍。5除了上述几方面的用途之外，微过滤技术用于蛋白质的浓缩也非常有效，只不过在过滤过程中需要进行搅拌，以阻止膜的堵塞而影响流速。这类滤膜对蛋白质及核酸类生物大分子也具有一定的吸附作用。62.2.3盐析法

随着盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度不断降低而沉淀析出，这称之为盐析(SaltingOut)。盐析作用是盐类使蛋白质脱去水化膜，同时压缩蛋白质分子周围的双电层，致使蛋白质分子相互聚集而沉淀。由于在合适的盐浓度下不同蛋白质的溶解度不同，所以分离几种蛋白质的混合溶液时，盐的饱和度由低向高逐渐增大。7盐析实验应注意的问题

1．盐类的选择盐析时常用中性盐类，要求：不会引起蛋白质变性，溶解度大，同时．溶解度受温度的影响小。最常用的是硫酸铵。

2．盐的饱和度

3．温度浓盐对蛋白质有保护作用，一般盐析操作可以在室温下进行，但有些对热敏感的蛋白质宜在低温下进行。

4.pH盐析时常选择在蛋白质等电点进行。

5．蛋白质浓度在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易发生沉淀，但浓度过高时容易使其它杂蛋白共沉淀。因此．必须根据具体情况选择蛋白质溶液的浓度。8脱盐用盐祈法分离纯化蛋白质后，常需要脱盐才能获得纯品，脱盐常用透析法或凝胶过滤法。92.2.4冷冻干燥

冷冻干燥(LyophilizationFreeze-drying)又称升华干燥，是在低温、负压下进行干燥的方法。主要用于除去冷冻样品中的水分或其它溶剂，这是浓缩和干燥热敏性样品(如抗体)的有效方法之一。将溶液样品通过冷冻干燥变成固体样品不仅可以使样品稳定而有利于长期保存，也有利于样品的运输。10冷冻干燥机11

需要注意的是：一般只有水溶液才能进行这样的处理。有机溶剂体系在冷冻干燥过程中有可能使生物大分子发生变性。同时，蒸发出来的有机溶剂进入真空泵，会污染或损坏真空泵。目前已经有商品化的抗有机溶剂及耐腐蚀的冷冻干燥器。122.2.5离心离心(Centrifugation)是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一，也是生化实验室中常用的分离、纯化或澄清的方法。尤其是超速冷冻离心已经成为研究生物大分子实验室中的常用技术方法。基本原理将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降的速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。131．离心力和相对离心力溶液中的固相颗粒做圆周运动时产生一个外向离心力，其定义为F=m2r

式中F为离心力的强度；m为沉降颗粒的有效质量；为离心转子转动的角速度，其单位为rad/s；r为离心半径(cm)，即转子中心轴到沉降颗粒之间的距离。14目的离心力通常以相对离心力RCF(RelativeCentrifugalForce)表示．即离心力F的大小相对于地球引力(G)的多少倍，单位为g，其计算公式如下：RCF=(1.11910-5)(rpm)2•r

可以看出：在同一转速下，由于r的不同，RCF相差会很大，实际应用时一般取平均值。在离心实验的报告中，rpm(或RCF)、r平均、离心时间t和液相介质等条件都应表示出来，因为它们都与样品的沉降速度有直接的联系15为了建立分子大小与沉降系数之间的关系，引入了沉降系数(SedimentationCoefficient)这一新的概念。沉降系数定义为沉降速度与离心力的比率或单位离心场中颗粒的沉降速度，它以Svedberg单位计算，1S＝1×10－13s。近年来，在生物化学、分子生物学及生物工程等书刊文献中，对于某些大分子化合物，当它们的详细结构和分子量不很清楚时，常常用沉降系数这个概念去描述它们的大小。如核糖体RNA(rRNA)有30S亚基和50S亚基，这里的S就是沉降系数，现在更多地用于生物大分子的分类，特别是核酸。16差示离心法要想实现组分间的分离，必须在所需样品沉降之后停止离心过程。沉积的样品再悬浮到新的溶剂中，并以较低的速度离心使大颗粒的污染物沉降，而被纯化的样品留在溶液中，经过反复多次地离心才能得到纯的样品，这种方法就叫差示沉降离心法(Differentialcentrifugation)，它对细胞组分间的分离非常有用。密度梯度离心在离心前离心管中溶液的密度不同(从上到下密度增大)，梯度介质中最大密度应小于样品物质的最小密度，其特点是物质的分离取决于样品物质颗粒的质量，即样品物质的沉降系数，而不是取决于样品物质的密度，因而适合于分离密度相近而大小和形状不同的物质。等密度离心也叫沉降平衡法。所谓等密度是指样品密度与介质的密度相等，实际上是在梯度密度介质中进行的。该技术的特点是沉降分离与样品物质的大小和形状无关，而取决于样品物质的密度。离心技术的类型17

2.3生物大分子的电泳分离纯化技术

电泳是带电离子或胶粒在电场中由于迁移速率的不问而被分离的过程。它已经成为生物化学家和分子生物学家分离和分析生物大分子的最主要的工具之一。电泳主要分为两种类型，即常规凝胶电泳和高效毛细管电泳，而常规凝胶电泳法又因介质的不同分为多种类型．其中最常用的为聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳。18电泳分离以电场中溶质的电泳迁移率差为基础．一种离子在电场中的迁移速率可用下式表示：=eE其中，为离子迁移速率；e为电泳迁移率，即当电场强度为1V/cm时离子的迁移速率；E为电场强度。

19上述比值相当于离子的荷质比，不同的离子具有独一无二的质量及电荷性质，因而在同一电场中和同一支持介质上电泳迁移率不同，从而能得到彼此间的分离。e电场力(Fe)摩擦力(Ff)对于给定的电场强度、离子及介质，电泳迁移率是该离子的特征常数，它与离子受到的电场力和摩擦力之间具有以下关系：202.3.1影响电泳分离的因素影响电泳分离的因素包括被分离物质本身的性质和电泳条件两个方面21物质本身的结构和性质电泳分离是根据物质的荷电性质，因此、被分离物质应带有电荷、或者在一定的条件下经过处理后带有一定的净电荷。被分离物质间荷质比差异越大，电泳分离的分辨率越好。被分离分子的荷质比差别越大，分离就越容易。除此之外，荷电分子颗粒的形状与电泳迁移率间也有关系，这主要是影响物质分子移动时的摩擦力，物质分子颗粒呈球形最为理想。22外部因意外部因素主要有支持介质、溶液性质及电场性质三个方面；1．支持介质目前，用于电泳的支持介质多种多样．除了天然纤维素、淀粉和琼脂糖以外，还有人工合成的聚丙烯酰胺等。在电泳过程中，支持介质对样品物质有可能产生一定的吸附作用，从而影响样品分离的分辨率及电泳迁移率。所以．要尽可能选择吸附作用小的材料作为支持介质。23支持介质的另一个影响因素是电渗作用(ElectricOsmosis)。所谓电渗，就是在电泳过程中，由于支持物吸附水合正离子(H3O+)或OH-，使溶液相对带正电或负电，在电场作用下溶液向相反的方向移动．这一现象就叫电渗。当电渗方向与被分离离子的移动方向相同时，电渗加速样品离子的移动，反之，则减小样品离子的移动速率。另一方面，固相介质解离的基团与荷电的样品分子会发生静电相互作用，这两种因素使得样品分子的正常分离受到一定的干扰。为此，要尽可能减小电渗作用的产生。合理选择支持介质是解决这一问题的关键措施之一。24

2．溶液介质溶液介质的性质与电泳分离密切相关，电泳所使用的介质都是缓冲溶液，溶液的pH和离子强度是两个最关键的影响因素。溶液的pH决定着样品分子的迁移方向。合适的pH可以使被分离样品之间的电荷性质差异更大。pH也是样品物质分子电泳迁移率的决定因素之一。25溶液中离子强度对电泳的影响主要有两个方面：一方面，离子强度大时，可使蛋曰质的带电量减小，其结果使电泳迁移率减小。另一方面，溶液中离子强度越大，通过溶液介质的分电流越大，而通过样品物质分子的分电流变小，从而降低了电泳迁移率。同时还增加了热量的产生，提高了环境温度。当离子强度过低时．降低了电泳总电流，减小了热量的产生，降低了电泳的环境温度．但扩散作用相对增加。同时，缓冲溶液的缓冲容量减小，pH变得难于控制，从而降低了电泳的分辨率和重现性。电泳介质的离子强度一般在0.5~0.1mol/L之间为宜。26

3．电场强度样品物质在支持介质上的电泳迁移速率与加在支持介质上的电压梯度成正比，电压梯度的单位以v/cm表示，它与支持介质的长度及加在支持介质两端的电场强度间的关系如下：一般来说，两极电压差在500v以内属常压电泳，其电场强度约在10～20V/cm。两极问的电压差在500v以上为高压电泳，电场强度约在20～200V/cm之间。由于高压电泳过程中产生大量的热，会使蛋白质变性，电泳缓冲溶液蒸发过多而使溶液的离子强度发生变化，这些都会影响电泳的分辨率。所以，高压电泳需要附有冷却装置，以保证电泳的环境温度在一个安全恒定的范围内。272.3.2聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PolyacrylamideGelEletrophoresis，PAGE)是近年来在生物化学和分子生物学中应用最广泛的一种电泳分离模式。这种凝胶具有多孔网状结构，样品物质在凝胶中移动除了电泳以外，还具有凝胶排阻层析中的分子筛效应，因而具有很高的分辨率。

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(1)聚合物分子中可电离的基团少，因而电渗作用小；

(2)对样品物质的吸附作用小；

(3)易于制备，并且可以易于回收；

(4)凝胶透明度好，几乎为无色透明，因而电泳过程容易观察和监测；聚丙烯酰胺凝胶之所以能被广泛地用作电泳的支持介质是因为它具有下述特点：29

(5)凝胶化学纯度高，对热稳定，不易对样品物质产生污染；

(6)凝胶孔径的大小可以按照需要进行控制．因而具有可控的分子筛效应，通过控制交联剂的浓度或聚丙烯酰胺的总浓度都可以达到控制凝胶孔径大小的目的；

(7)该凝胶在270nm处没有光吸收，有利于样品蛋白质和核酸电泳后的扫描检测。同时，该凝胶富含酰胺基，其凝胶具有稳定的亲水性，又不带电荷，故凝胶在电场中几乎没有电渗作用，是一种理想的电泳支持物。30聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用

1．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)测定蛋白质的分子量通常所用的电泳技术不能测定蛋白质的分子量，因为在这些电泳中物质分子的电泳迁移率取决于物质分子的净电荷和分子的大小。而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)可用于测定蛋白质的分子量。31

SDS的化学名为十二烷基硫酸钠。蛋白质分子用SDS处理后多肽链变成无规则线团状态。加入SDS的同时，还加入破坏二硫键的巯基乙醇。SDS和变性蛋白质多肽键以1.4g比1.0g的恒定比例相互结合，形成蛋白质－SDS复合物，由于SDS带大量的负电荷，蛋白质本身的负电荷已被SDS所屏蔽掉。这样，复合物的迁移率不再取决于蛋白质的荷电性质，而是取决于蛋白质分子的大小。分子量大的分子在单一通道的凝胶网孔中移动时受到的阻力较大，较小的分子具有较大的迁移率，分子量的对数与电泳迁移率成线性关系，据此可以测定蛋白质的分子量。3233

2．蛋白质等电聚焦电泳等电聚焦(IsoelectricFocusing，IEF)是研究蛋白质的另一有效的方法。设计一种装置，在同一块凝胶板上形成不同pH梯度的区带，如某一样品有A和B两种蛋白质，A的等电点pI＝4.8，B的pI＝7.8，现在将样品放在具有不同pH梯度的凝胶板上的任一个pH区域内。比如：样品放在pH＝5.7的区域内，在这种情况下，蛋白质A带净的负电荷，而B则带净的正电荷，在电场的作用下，A和E分别向正极和负极移动。当分别移动至各自的pI区域时二者所带的净电荷均为零，所以便停留在该区域不再向任何一个方向移动。由此可见，等电聚焦不仅可以分离和浓缩蛋白质，而且可同时测定蛋白质的等电点，因为每种蛋白质都具有特定的等电点。34蛋白质等电聚焦示意图等电聚焦过程中最关键的问题是保持凝胶介质pH梯度的稳定性，防止由于扩散或对流破坏pH梯度。35在聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶中形成稳定pH梯度的最常用的方法是通过电泳一种人工合成的两性聚合电解质而形成，该电解质因含有大量的氨基，羧基或磺酸基而具有广泛的pH范围。如果样品蛋白质的pI值为已知，可选持包括该pI在内的较小pH范围的两性电解质；如果样品蛋白质的pI值为未知，则应选择广泛pH范围的两性电解质(pH3-10)，然后根据粗测值再选择较窄pH范围的两性电解质，以达到高的分辨率。36点样的方法有两种，对浓缩的脱盐样品，可直接铺放在凝胶的顶端。另一种方法是在制备凝胶时，同时加入蛋白质样品。电泳时，聚合电解质比蛋白质移动得快，凝胶中总是在蛋白质未达到pI位置之前pH梯度已经形成。电泳之后，不可用染色剂直接染色，因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合。为此，可先将凝胶浸泡在5％的三氯乙酸中以除去两性电解质，然后再用考马斯亮蓝等染色。373.二维电泳(Twodimensionalgelelectrophoresis)由于生物样品中蛋白质种类繁多，当一些蛋白质的分子量比较接近，或者等电点比较接近时，单一的聚丙烯酰胺凝胶电泳或等电聚焦无法将蛋白得到有效分离，因此，可采用先等电聚焦后再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，使不同蛋白得到有效分离。这种方法叫二维电泳。38二维电泳结果392.3.3琼脂糖凝胶电泳(AgaroseGelElectrophoresis)特点聚丙烯酞胺凝胶电泳法只适合于蛋白质及一些较小的DNA片段的分离分析，样品的分子量一般不超过3.5105KD。由于凝胶孔径大小的限制，不适合于分子量较大物质的分离分析。而琼脂糖凝胶具有较大的孔径，琼脂糖凝胶电泳目前已成为RNA和DNA检测、分析、分离和性质研究的标准方法。琼脂糖凝胶电泳没有PAGE法相关的毒性问题，样品的染色和脱色迅速。由于成胶时无自由基及催化剂参加，所以是非化学活性的。该凝胶透明，干燥后可直接用紫外分光光度计定量，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好，并可做成永久记录而保存。40实验方法

DNA分子的凝胶电泳一般分为三个步骤；

(1)制备一定浓度的琼脂糖凝胶，使其适合于被分离DNA分子的大小；

(2)将DNA样品加到样品并中，凝胶在一定的电场强度下电泳一定的时间，使之达到最佳分离；

(3)凝胶染色，或当溴乙锭被加入到凝胶和电泳缓冲溶液时可直接用紫外灯照射以观察荧光。41应用

1．限制性核酸内切酶存在下酶切DNA片段的分析完整的DNA分子，在特定的限制性内切酶的存在下，会产生大小不同而具特定数量的DNA片段。完整的DNA分子的一级结构决定了可能产生的DNA片段的数量及每个酶切片段的大小。用琼脂糖凝胶电泳分离分析