实验动物学-免疫缺陷动物与转基因动物

第七章免疫缺陷动物与转基因动物

主要内容一、免疫缺陷动物基本概念免疫缺陷动物的分类常用免疫缺陷动物的特点和应用二、转基因动物基本概念转基因动物的命名目前制作转基因动物的主要方法转基因动物研究的意义及应用第一节免疫缺陷动物一、基本概念免疫缺陷（immunodeficiencydiseases)是免疫系统中任何一个环节或其组分因先天发育不全或后天因各种因素所致损害而使免疫活性细胞的发生发展、分化增殖和代谢异常并引起免疫功能不全所出现的临床综合征。免疫缺陷动物（immunodeficientanimal)是指由于先天性遗传突变或用人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。免疫缺陷病大体分为两类：1、先天（或原发）性免疫缺陷，可导致对病原微生物的高度易感性；2、获得（或继发）性免疫缺陷，可由于营养不良、恶性肿瘤、免疫抑制药物治疗或是免疫活性细胞受到病毒的感染。如HIVAIDS。二、免疫缺陷动物的分类1、先天性免疫缺陷动物2、获得性免疫缺陷动物目前，世界各国相继培育出一系列免疫缺陷动物，从啮齿类扩展到马和牛等大型哺乳类动物；从单一的T淋巴细胞免疫缺陷到几种免疫细胞联合缺陷。

三、常用免疫缺陷动物的特点和应用1、裸小鼠（Nudemice）即先天性无胸腺裸小鼠，由11号染色体上nu隐性基因突变导致。该基因已回交到不同品系，包括：NIH-nu/nu、BALB/c-nu/nu、C3H-nu/nu、C57BL/6-nu/nu。具有纯合裸基因（nu/nu)的小鼠主要的缺陷特征：1、毛发生长发育异常，表现为全身形似无毛，呈裸体外表；2、无胸腺，仅有胸腺残迹或异常的胸腺上皮，这种上皮不能使T细胞正常分化，缺乏成熟T细胞的辅助、抑制及杀伤功能，因而细胞免疫力低下，不能执行正常T细胞功能。BALB/c-nu的胸腺昆明小鼠的胸腺3、裸小鼠的B细胞功能基本正常，成年裸小鼠（6~8周龄）较普通鼠有较高水平的NK细胞活性，但幼鼠（3~4周龄）的NK细胞活性低下，裸小鼠粒细胞数比普通小鼠低。4、繁育能力差，乳腺发育缺损，以雄性纯合子与雌性杂合子繁育。5、T细胞缺陷可通过移植成熟T细胞、胸腺细胞或正常胸腺上皮得到校正。裸鼠作为实验动物是一种奇迹，在研究人癌方面具有独一无二的特点，它是人癌研究的“活试管”，为人们研究肿瘤提供美妙的动物模型原来科学家们先用一种高分子材料做成“人耳”的模型支架，然后让人体的软骨组织细胞在这个支架上繁殖生长。一周后，在裸鼠的背上割开一个口子，将培育过的这个“人耳”模子植入缝合，随着人体软骨细胞不断增殖，支架慢慢地被机体降解吸收，使“人耳”和裸鼠融为一体。当然，这个“人耳”的软骨组织来自人体，而“人耳”外的皮肤则来自裸鼠裸小鼠（

Nudemice）裸大鼠(NudeRats)

2、裸大鼠（Nuderat）裸大鼠的基因符号为rnu。纯合子裸大鼠（rnu/rnu），一般特征似裸小鼠。发育迟缓，体重为正常大鼠的70%。裸大鼠较裸小鼠对多种传染病更敏感。比裸小鼠更强壮、寿命更长。体型较大，可提供足够的血样、也可为各种研究提供足够的瘤组织及对大范围的外科手术方法较有利。裸大鼠(NudeRats)

封闭群（OutbredMice）来源：

1979-1980年期间，含有裸基因的8个近交系大鼠(BN、MR、BUF、WN、ACI、WKY、M520、F344)在一系列交配之后育成了NIH裸大鼠。

2001年CharlesRiver从NIH引入，命名为Crl:NIH-Foxn1rnu。该品系没有胸腺，缺乏T细胞，在胸腺外周淋巴器官的主要区域表现为细胞群体衰竭特征

3、性连锁免疫缺陷小鼠性连锁免疫缺陷小鼠（X—linkedimmunedeficiencymouse,XID)起源于CBA/N小鼠，其B细胞功能缺陷，基因符号xid位于X性染色体上。纯合子雌鼠（xid/xid）和杂合子雄鼠（xid/y)对非胸腺依赖性Ⅱ型抗原没有体液免疫反应，血清中IgM和IgG含量降低，其T细胞功能基本正常。该模型是研究B淋巴细胞的发生、功能与异质性理想的动物。4、Biege(bg)小鼠为NK细胞活性缺陷的突变系小鼠，隐性突变基因bg位于第13号染色体上。目前常使用的主要为C57BL/6J系beige小鼠纯合鼠被毛完整，但毛色变浅，耳廓和尾尖色素减少，出生时眼睛颜色很淡。此小鼠表型特征与人的齐—希二氏综合症（Chedian—Higashisyndrome)相似。5、严重联合免疫缺陷小鼠SCID小鼠，是位于第16号染色体的scid单个隐性突变基因所导致。外观与正常小鼠无异，生长发育正常胸腺、脾、淋巴结的重量一般为正常小鼠的30%，组织学上表现为淋巴细胞缺失。所有T、B细胞功能测试均为阴性。SCID是由SevereCombinedImmune-deficiency缩写而来，最早此一症状是1950年在人类的婴儿中发现。直到1983年才首次在CB-17品系小鼠中发现SCID症状。SCID的特征为丧失B与T淋巴球的功能，造成低免疫球蛋白血症，但不意味在SCID小鼠体内完全没有B与T淋巴球，应该说SCID小鼠体中没有成熟的B与T淋巴球，来足以担当有效的免疫功能。SCID小鼠巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞、红细胞等均呈正常状态，NK细胞及淋巴激活因子（LAK）也呈正常。其外周血白细胞较少，淋巴细胞占白细胞总数的10%--20%，而正常小鼠应占约70%。SCID小鼠需要饲养于SPF屏障系统环境。SCID小鼠的肿瘤移植率高，对白血病和恶性肿瘤不但转移率高，而且能广泛扩散，与人体肿瘤生物学行为极为相似。SCID小鼠的Leaky现象：在临床表现上，约有2-23%子代具有少量的淋巴样细胞，并产生少量的免疫球蛋白的现象。随着SCID小鼠年龄的增长与暴露于抗原刺激下，会增加其Leaky现象。饲养在SPF环境中，借干净的环境、较少的抗原刺激，减缓Leaky现象出现，争取可供实验的时间。在繁殖SCID小鼠时，监测血清IgM为一种有效的筛选种鼠的方式。SCID—hu小鼠是科学家通过移植人免疫组织或免疫细胞，使SCID小鼠具有了部分人类免疫系统，称为SCID—hu小鼠。该小鼠用途也十分广泛。目前已用于人类生理学、病理学、病毒学、免疫学和血液学的研究。它也用于药物筛选和疫苗效应与安全性的试验。SCID小鼠—SHO

无毛封闭群小鼠模型SHO（SCIDHairlessOutbred）Crl:HA-Prkdcscid和Crl:SKH1-Hrhr杂交而成美国CharlesRiverLab自2007年开始培育，在2008年得到了两条染色体上均带有SCID基因的无毛的SCID小鼠。将人前列腺癌细胞株PC-3分别接种到SCID和SHO身上对比，研究发现，SHO除去具有与SCID小鼠相同的肿瘤生长特性之外，还摒除了Nu/Nu裸鼠接种PC-3时出现的皮肤溃疡现象。SCIDBeige专业名称：CB17.B6-PrkdcscidLystbg/CrlVr

近交系（InbredMice）来源：

该品系为scid和beige常染色体隐性突变同类系小鼠该品系由Croy等在Guelph大学通过C.B-17scid/scid和C57BL/6bg/bg小鼠的杂交得到该品系B、T淋巴细胞功能缺失，同时自然杀伤细胞(NK细胞)功能低下

1993年CharlesRiver引入该品系NODSCID

JaksonLab用非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt与SCID小鼠杂交得到降低了Nk细胞活性，杂交双突变小鼠NOD/Lt-SCID表达了NK细胞活性相对低的特性。

Nu/Nu裸鼠

封闭群（OutbredMice）来源：

此免疫缺陷鼠来源于NIH

开始被认为是BALB/c的同类系

后来表明此鼠不是近交小鼠，并以远交方式保存下来

此小鼠没有胸腺，是免疫缺陷鼠，不能产生T细胞

国内常用免疫缺陷大小鼠对比（1）BALB/c-nu来源于BALB/C小鼠基因突变（2）Nu/Nu裸鼠（注意首字母大写）由NIH培育成功，是一个独立的品系（3）CD-1裸鼠，将nu基因导入CD-1小鼠获得该品系。Nu/Nu、CD-1裸鼠为封闭群，随机交配方式进行繁殖，后代基因纯合程度低，个体间差异大第二节转基因动物随着现代高新科学技术的发展，现代实验动物学已从过去注重于动物饲养管理和实验操作的宏观向微观方向发展。对小鼠基因组研究的目的不仅在于了解小鼠本身的基因结构，更主要的是为人类基因组研究、人类遗传疾病研究提供动物模型。

一、基本概念转基因动物（Transgenicanimal）:是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞中并遗传给后代严格说，转基因动物有别于嵌合体。基本原理:

目的基因或基因组片段受精卵或着床前胚胎细胞受体动物的输卵管或子宫中

携带有外源基因的转基因动物嵌合体动物：只有部分组织细胞整合有外源基因的动物，称嵌合体动物。基本原理：A动物的ES细胞B动物动物的囊胚代孕鼠的子宫生产出嵌合体动物与杂合体的区别，杂合体是由来自不同的物种的两个配子形成的，如骡子是驴与马结合创造的一个杂合体，而不是嵌合体。马（2n=64）

驴（2n=62)克隆动物（clone）概念：指动物通过体细胞进行的无性生殖以及由无性生殖形成的基因型几乎完全相同的后代个体组成的群体。原理1982年––第一只转基因小鼠RichardPalmiter

和RalphBrinster

领导的一个小组将一个能够被锌调控的DNA元件与大鼠的生长激素基因连在一起，并将其注射到了受精了的小鼠胚胎中，从而培育出了第一批转基因小鼠。这些转基因小鼠长期取食含有足量锌的食物后，就会长得非常大。转基因小鼠的出现掀起了遗传学研究的新的浪潮。1983年––PCRKaryMullis发明了聚合酶链式反应（PCR），这是一种能够极其快速的获得特定DNA片段的方法。目前PCR已成了生物学实验室中的不可缺少的常规技术，在全世界都被广泛使用。Millis因这项了不起的发明获得了1993年的诺贝尔奖。

1987-89年––第一只基因敲除小鼠MartinEvans，OliverSmithies和MarioCapecch

领导的几个研究小组对胚胎干细胞中特定目标基因进行失活，培育出了第一只基因敲除小鼠。这三位科学家因为这项工作在2001获得了Lasker奖。接下来，科学家们用同样的技术又培育出了几千只基因敲除小鼠。于2007年获诺贝尔奖。

1998年––

第一只克隆鼠

在1997年克隆羊“多莉”诞生之后，夏威夷的一个小组培育出了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹们。1999年--小鼠基因组测序协会在1990年人类基因组计划启动之初，该计划就将小鼠列为了必须进行测序的五个重要的模式生物之一。1999年，人类基因组三个主要测序中心成立了一个相互协作的小鼠基因组测序机构，取名为小鼠基因组测序协会（MGSC）。小鼠基因组测序项目正式启动，到2002年，MGSC已经发展到了拥有6个国家的26个研究机构。2001年2月--人类基因组

在人类基因组计划正式启动之后的第十一年，人类基因组的第一张测序草图完成并公布于众。同时发表的人类基因组草图有两份，一份由公共基金资助的国际人类基因组测序协会完成，发表在Nature上，另一份由CraigVenter领导的一家美国私人测序公司CeleraGenomics完成，发表在Science上。2001年6月--散弹法

美国公司CeleraGenomics使用散弹法测得了用于销售的小鼠序列草图。散弹法是一种一次性测得基因组全序列的技术。签订一份三年的合同后，私人客户只用45000美元就可以得到5倍覆盖率的小鼠基因组序列数据。Celera公司的序列基于四个小鼠株系，其中包括了DBA株系，但不包括公共基金项目已经在测的C57BL/6J株系。2002年5月––16号染色体

RichardMural等人对Celera公司测得的小鼠16号染色体序列作了分析，并将结果发表在Science上。他们发现该染色体上有一大段区域与已被分析的人类21号染色体序列高度相似。2002年8月––小鼠基因组物理图谱

一个国际协会提供了通过构建基因组物理图谱来详细确定DNA序列的框架。小鼠和人类间大量序列的相似性使得解码小鼠序列变得相对容易；反过来，小鼠的图谱也能用来填补人类基因组序列中存在的空缺。2002年12月

––小鼠基因组小鼠基因组测序协会发表了一份高质量的小鼠基因组序列草图，同时对C57BL/6J小鼠株系做了分析。这个基因组大小约为2.5Gb，比人类基因组要小，预计的基因也少于30000个。约有40%的小鼠和人类基因组序列相高度似性，80%的人类基因在小鼠基因组中能找到相应的基因。同时还有不少文章对小鼠遗传组成的其它方面做了详细讨论。在日本RIKEN基因组科学实验室的努力下，很多相关的重要资源都能够被免费获取。

转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动，它将对整个生命科学产生全局性影响。因此转基因动物技术在1991年第一次国际基因定位会议上被公认是遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术，被列为生物学发展史上126年中第14个转折点。二、命名1．符号(1)一个转基因符号由以下三部分组成：TgX(YYYYYY)＃＃＃＃＃Zzz，TgX=方式；(YYYYYY)=插入片段标示；＃＃＃＃＃=实验室指定序号；Zzz=实验室注册代号；(2)方式—TgX转基因符号通常冠以Tg字头。随后的一个字母X，表示DNA插入的方式：

H代表同源重组；

R代表经过逆转录病毒载体感染的插入；

N代表非同源插入。（3）插入片段标示—(YYYYYY)是由研究者确定的表明插入基因显著特征的符号。通常由放在圆括号内的字符组成：可以是字母（大写或小写），也可由字母与数字组合而成，不用斜体字，上下标、空格及标点等符号。应注意以下几点：1）标示应简短，一般不超过六个字符。2）如果插入序列源于已经命名的基因，应尽量在插入标示中使用基因的标准命名或缩写，但基因符号中的连字符应省去。3）插入片段标示只表示插入的序列，并不表明其插入的位置或表型。一些标示的标准命名缩写：

An匿名序列；Ge

基因组；

Im

插入突变；Nc

非编码序列；

Rp

报告基因；Sn

合成序列；

Et增强子捕获装置；

Pt启动子捕获装置。（4）实验室指定序号及实验室注册代号实验室指定序号：是由实验室对已成功的转基因系给予的特定编号，最多不超过5位数字。而且，插入片段标示的字符与实验室指定序号的数字位数之和不能超过11。实验室注册代号：是对从事转基因动物研究生产的实验室给予的特定符号。2.举例

C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg：

来源于美国杰克逊实验室（J）的C57BL/6品系小鼠被转入人的CD8基因组（Ge）；转基因在JonW.Gordon(Jwg)实验室完成，获取于一系列显微注射后得到的序号为23的小鼠。

转基因符号缩写:C57BL6J-TgN23JwgTgN(GPDHIm)1Bir以人的甘油磷酸脱氢酶基因（GPDH）插入（C57BL/6JXSJL/J）F1代雌鼠的受精卵中，并引起插入突变（Im），这是EdwardH.Birkenmeier(Bir)实验室命名的第一只转基因小鼠。根据转基因动物命名原则，如果转基因动物的遗传背景由不同近交系或远交群混合而成时，该转基因符号不使用动物品系或种群的名称。缩写：TgN1Bir三、遗传修饰动物模型的建立方法1、转基因技术：目的基因整合受精卵（或胚胎干细胞）导入受体子宫发育成含目的基因的个体，此个体能把目的基因遗传下去。2、核移植技术:又称动物整体克隆技术。将一个体细胞的核导入另一个体的去核卵细胞中，使之发育成个体。3、基因剔除技术：又称基因靶向灭活。指有目的地去除动物体内某种基因的技术。基本原理是同源重组技术。导入基因的主要方式显微注射法ES细胞法电穿孔脂质体逆转录病毒感染法精子载体导入法等（一）雄原核显微注射法以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。

目前应用较广泛，最早最经典的方法。一、设计转基因构件

1、目的基因的获取

2、基因载体（复制子）的选择与构建3、目的基因与载体的连接（连接酶）：重组DNA分子二、动物操作

1、准备假孕母鼠（养母）2、受精卵的准备3、基因导入4、胚胎移植5、对幼鼠的鉴定

转基因工作需要的动物1、需要的野生型小鼠类型包括：幼龄雌鼠（21-28天）用作胚胎供体；成年雄鼠；成年雌鼠，作为胚胎移植的受体；输精管结扎的雄鼠，用来产生假孕雌鼠；青年野生型雄鼠和雌鼠，与转基因鼠交配，建立转基因品系。2、从胚胎移植到成年小鼠总计约11周的时间胚胎移植约19天幼鼠约21天断乳小鼠约4-5周成年小鼠约19天幼鼠。原核注射法制备转基因鼠技术路线优点：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观；整合率高缺点：设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性转基因沉默（二）胚胎干细胞（ES细胞）法ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。在ES细胞上的基因操作：可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。优点：外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。缺点：ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体（三）完全基因剔除转基因动物完全基因剔除