分子克隆基本概念DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作

分子克隆基本概念:

DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆(molecularcloning)或基因克隆。所谓克隆(clone)：是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程基因工程：利用分子克隆技术来操作目的基因，并改变生物的遗传性状的过程就称为基因工程。从某种意义上说，重组DNA技术也可直接理解为基因工程，但基因工程的涵义更广泛，还包括除DNA重组技术以外的改造生物基因组结构和功能的其他技术和方法．例如20世纪80年代衍生出的蛋白质工程、RNA重组技术等等。基因工程最基本的必备的材料：工具酶载体目的基因原核或真核宿主细胞分子克隆的基本过程:1.分：得到目的基因2.切：将目的基因和载体用适当的限制性内切酶切割。3.接：将目的基因和载体连接，形成重组子。4.转：将重组子转到适当的宿主细胞中。5.筛：筛选出含有正确重组子的宿主细胞，扩增。第一节

分子克隆中常用工具酶分子克隆中对DNA、RNA分子的操作常涉及到一系列酶促反应，这些酶是进行基因克隆时必备的基本工具。例如，使DNA分子内部发生断裂的核酸内切酶、将两种DNA分子连接在一起的DNA连接酶、以mRNA为模板合成cDNA的逆转录酶等。目前这些工具酶已商品化，广泛应用于分子生物学的各个领域。本节将着重讨论基因工程中重要工具酶的特性和用途。工具酶分类

1.使核酸降解的核酸酶类：核酸内切酶、核酸外切酶。

2.催化核酸合成的酶类：

DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。

3.核酸修饰酶类；甲基化酶，激酶，基团转移酶，磷酸酶等。一、

限制性核酸内切酶：概念的提出及背景：30年代初，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染。如E.coliK株的噬菌体只能感染E.coliK株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象成为——限制现象。但某些被菌体限制的噬菌体群中，有少数能幸存下来，并在菌体中繁殖，这种现象称为——修饰现象。1962年W.Arber提出；菌体中含有2种以上功能不同的酶：1.

核酸内切酶：能识别切断外来DNA分子的某些部位，使其使去活性，限制外来只菌体的繁殖——限制性核酸内切酶；菌体的防御系统。2.

修饰酶：也能识别限制性内切酶所识别的序列，并把某些C或A甲基化，使其不被RE降解——菌体保护自身DNA系统。

限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease，RE)是由细菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌体内，这种内切酶可以分解外源性的DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护。这种细菌内部的限制与修饰作用分别由核酸内切酶和甲基化酶完成，构成了类似免疫的防御系统。1．限制性核酸内切酶的分类：按照限制性核酸内切酶对辅助因子的需求与否，以及切割DNA链的特点，将已发现的限制性内切酶分为3种类型：I、Ⅱ、Ⅲ型。

I型RE：由三种不同的亚基组成。需Mg++，S-腺苷甲硫氨酸（SAM），ATP为辅助因子；识别位点复杂，特异性差。通常在识别位点的400~7000bp范围内切割DNA。现已报道19种。Ⅲ型RE；由两种亚基组成。需Mg++，ATP为辅助因子；切割位点靠近识别序列但较难预测。一般在25~27bp范围内切割。现已报道4种。I、Ⅲ型RE酶同时具有限制(剪切)与修饰(甲基化)两种功能并依赖于ATP，切割DNA链的位置远离识别序列，因此I型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中都不常用。Ⅱ型限制性内切酶实际应用价值最大，这是因为：①

Ⅱ型酶只具有限制性活性，无甲基化修饰活性；②

对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确；③

此类酶作用时只需要Mg2+参与。无需ATP。因此Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。2．限制性内切酶的命名目前已广泛采用H．O．Smith和D．Nathams于1973年提出的命名系统：限制性内切酶第一个大写字母——来自细菌的属名(genus)，第二、三个小写字母——来自种名(species)，第四个字母代表菌株(strain)：如果从一种菌株中发现了多种限制酶，则根据发现和分离的顺序用罗马字母表示。例如从流感嗜血杆菌D株中分离到的限制酶分别表示为HindI、Ⅱ、Ⅲ，EcoRI。3．Ⅱ型限制性内切酶的作用特点：Ⅱ型RE酶：被分子生物学家广泛研究应用，现已发现有200多种识别序列的RE。但除原形外还有许多不同来源的同裂酶（异源同工酶），因此Ⅱ型RE超过1500种。Ⅱ型RE：MW=60KD的单链多肽，最适pH：6~8，NaCl有抑制作用，Mg2+激活，巯基有保护作用;热不稳定。作用特点：1.

有严格的识别、切割的DNA序列，并以内切的方式水解双链DNA分子中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。2.识别序列一般为4～6个碱基对，并以切割序列的正中作为轴心，成180°反向重复(invertedrepeat)。这种结构也称为回文结构(palindrom)。

3.

Ⅱ型酶切割靶序列的大小决定了切割DNA链后产生的DNA片段的长短，即识别序列短，则DNA链中可能存在的切点多，产生DNA片段短；识别序列长，则DNA链上存在的切点少，产生DNA片段长。按照识别序列的长短可估算RE对DNA的切割概率。如：识别4bp的某RE，其切割概率为1/44=1/256，即平均相距256bp有一个切割点；识别序列为6bp的RE，其切割概率为1/46=4096。4.切割后产生平头或粘性末端。5.Ⅱ型RE酶只需Mg2+，不需ATP。

Ⅱ型酶切割双链DNA可产生两种不同的切口1.平头末端(bluntend)即在识别序列的对称轴上进行切割，例如HaeⅢ识别序列为5’-GGCC-3’，其切点在G与C之间；2.

粘性末端(cohesiveend)即在识别序列的两个对称点切开DNA双链，产生末端带有单链尾巴的切口。粘性末端又可分为两种：从DNA分子5’端切割产生5’端突出的粘性末端称为5’粘性末端．如EcoRI；从3’端切割产生3’端突出的粘性末端称为3’粘性末端，如PstI。

限制性内切酶(RestrictionEndonuclease)三类特殊性质的Ⅱ型限制性内切酶：(1)同裂酶(isoschizomer)：又称异源同工酶，即从不同原核生物中分离出来的不同的Ⅱ型酶有相同的识别特点，但切割位点可以相同，也可以不同，例如SamI(CCC↓GGG)和Xma

I(C↓CCGGG)

(2)同尾酶(isocaudarmer)：不同来源的酶其识别和切割序列有一定的相关性，作用后能产生相同的粘性末端，例如BamHI(GGATCC)。同尾酶产生的DNA片段能通过粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来，这在分子克隆中有一定的作用。但应当注意有时用两种同尾酶产生的末端，重组后形成的序列再也不能被原来的任何一种同尾酶所识别。例如；同尾酶可用于克隆载体的改造和构建中，用以消除某些限制酶切点，但如果要回收重组克隆中的插入片段时，则要慎重选择适当的同尾酶。Sau3AIBamHIGATC GGATCCCTAG CCTAGG

SauI XhoIGTCGAC CTCGAGCAGCTG GAGCTC(3)可变酶：此种酶所识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个碱基对，例如BstpI识别序列为：GGTNACC，其中N为一可变碱基。RE识别序列呈反转对称结构，可分为四种类型1.

回文结构：（Palindrome）↓如：EcoRI：5，—G

AATTC—3，

3，—CTTAA

G—5，

↑2.间断回文结构（interruptedPalindrome）↓如：BgI：5，—GCCNNNN

NGGC—3，

3，—CGGN

NNNNCCG—5，↑3.

简并序列（degenerateｓｅｑｕｅｎｃｅ）又称“松弛”特异识别，即识别位点中某些核苷酸可以被其他核苷酸替换。↓如：ＡｖａⅡ：5，—ＧＧＡ／ＴＣＣ—3，

3，—ＣＣＴ／ＡＧＧ—5，↑４.非回文结构：

↓如：ＭｂｏⅡ：5，—ＧＡＡＧＡＮ８—3，

3，—ＣＴＴＣＴＮ７—5，↑4．限制性内切酶的应用一、限制性内切酶除作为基因工程中剪切DNA的工具外，还广泛应用于分子生物学研究的各个领域内。１.

绘制基因的物理图谱及基因同源性比较。２.

测定基因的核苷酸序列、基因组DNA分析。３.

基因突变与遗传性疾病的诊断等。例如DNA分子如具有某种限制性酶切位点，该酶就能对之剪切，产生特异片段；而不同的DNA分子由于序列不同，酶切产生的片段也就不同，由此就能获得该DNA分子的物理图谱。４.

改造及重组质粒。５.

ＤＮＡ克隆及亚克隆的建立。

ＲＥ使用时的注意事项

１.

要求较纯的底物DNA。２.

Mg2+和Tris-HCl缓冲体系，并且大多数内切酶活性pH范围在7．2—7．6之间；３.

同时反应体系中不能含有酚、氯仿、乙醚、SDS以及大于10mmol／L的EDTA；４.

对离子强度的要求分为3个级别，高盐(100mmol／LNaCl)，中盐(50mmol／LNaCl)，低盐(0～10mmol／LNaCl)。５.在酶反应缓冲体系中均添加有二硫苏糖醇或β-巯基乙醇，以稳定酶活性防止氧化。６.在具体试验操作时应在低温或冰浴条件下完成。二、DNA聚合酶DNApolymerase分子克隆常用的DNA聚合酶：依赖DNA的大肠杆菌DNA聚合酶I。Klenow片段。T4噬菌体DNA聚合酶。T7噬菌体DNA聚合酶。经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。（测序酶）耐热DNA聚合酶。依赖RNA的DNA聚合酶。（逆转录酶）

1．DNA聚合酶I：DNA聚合酶I是Kornberg从大肠杆菌中发现的第一个DNA聚合酶，商品名称为kornberg酶，分子量109KD。此酶是一个多功能酶，包括3种酶活性：①

5’-3’聚合酶活性：催化单核苷酸聚合到DNA的3’-OH末端，使DNA链从5’-3’延伸；②5’-3’外切酶活性：即从游离的5’末端降解双链DNA或单链DNA成为单核苷酸③3’-5’外切酶活性。另外该酶还具有RNA酶H活性。DNA聚合酶I作用条件：①

全部4种dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、Mg2+②

DNA作为模板，单链DNA或有缺口的双链DNA均可；③

需要具有游离3’-OH的引物或缺口的3’末端DNA聚合酶I的应用：①

催化DNA缺口平移(nicktranslation)反应，制备高比活性DNA探针②

第二条cDNA链的合成；③

对DNA3’凸出末端进行末端标记；④

DNA序列分析2．Klenow片段

C末端大片段——Klenow片段（70KD）

含5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性

（保证了DNA复制的精确性）枯草杆菌蛋白水解酶

DNA聚合酶I

N末端小片段含5’-3’外切酶活性

Klenow片段功能：１.双脱氧法序列分析。２.随机引物标记核酸探针。３.cDNA第二链合成。4.

对5’凸出粘端不平或对双链DNA3’端标记。5.PCR技术：PCR技术是根据Klenow酶的5’-3’聚合活性而设计诞生的。但是Klenow酶对热不稳定，现已不用。通常所用的大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段是由枯草杆菌蛋白酶水解而成或经过基因工程制备。3．T4噬菌体DNA聚合酶从T4噬菌体感染E.coli中获得。MW=114KD单链多肽。活性与Klenow片段相似：5’-3’聚合活性；3’-5’外切活性。特点：1.外切活性=Klenow片段外切200倍。2.外切活性的强度：单链底物大于双链底物。应用：1.补平或标记5’凸出粘端。2.对DNA3’凸出粘端进行末端标记。用3’-5’外切活性切除3’凸出粘端，甚至形成5’凸出粘端，再用高浓度dNTP标记掺入，利用5’-3’聚合活性获得标记物。3.通过取代反应，标记核酸探针。5’3’3’5’T4DNApol3’—5’外切活性

5’3’3’5’T4DNApol32PdNTP

5’3’3’5’ECoRI，BamHIRE消化

5’3’5’3’3’5’3’5’

凝胶电泳提取纯化特异探针4.TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是一种依赖DNA的单亚基耐热DNA聚合酶，分子量约为65000D。该酶最初由极端嗜热水生菌Thermus

aquaticus中提取并纯化，目前已能通过基因工程方式大量生产。TaqDNA聚合酶的应用TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)中，能以DNA为模板，从结合在模板上的引物出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从5’-3’方向合成新的DNA链。TaqDNA聚合酶在70～75℃时具有最佳的生物活性，随着温度的降低，酶活性明显下降。同时此酶缺乏3’-5’外切酶活性，因而无校正功能。

TaqDNA聚合酶的应用条件需Mg2+（1.mmol/L）。低浓度Mn2+（2mmol/L）有低活性。Ca2+使其完全失活。一价阳离子高至0.1mol/L对其活性无影响。最适浓度：NaCl=40mmoL/L

KCl=60mmol/L最适pH：7.8Tris-HClbuff三、DNA连接酶：催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键形成的酶，称为DNA连接酶(DNAligase)。DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶

1．T4噬菌体DNA连接酶T4DNA连接酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现并分离的，分子量68kDa。

主要功能及用途①

连接双链DNA中一条链上的缺口催化Km=1.5pmol/L②

间存在的互补粘性末端的DNA片段Km=0.6umol/L。（连接反应通常在12—15℃下进行）③

DNA分子间的平头末端Km=50umol/L（平端的连接通常在室温下进行）有报道T4DNA连接酶可以用于RNA连接，但效率低。2．大肠杆菌DNA连接酶特点：1.连接双链DNA中一条链上的缺口催化2.间存在的互补粘性末端的DNA片段需

NAD+3.连接平头末端DNA分子需聚乙二醇或

Ficoll1.2.情况下可代替T4DNA连接酶，它产生的背景低，准确性高。大肠杆菌DNA连接酶功能1.可修复双链DNA中的单链切口，并可催化互补黏性末端的连接，主要用于cDNA第二链的合成。2.在正常反应条件下该酶不能连接平端，但如果在反应体系中加入体积排阻剂聚乙二醇时能促进平端连接，但效率仍很低；3.此酶在非平端连接时可代替T4DNA连接酶，它产生的背景低，准确性高。

四、反转录酶：能以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶称为反转录酶(reversetranscriptase，RT)，合成的DNA产物称为互补DNA(complementaryDNA，cDNA)。反转录酶的作用特点：1.反转录酶以单链RNA或单链DNA为模板，以4种dNTP及游离3’-OH为引物，按5’-3’方向合成DNA；2.可用于cDNA第一链和第二链的合成，同时逆转录酶有5’-3’和3’-5’RNA外切酶活性(3’-5’切活性又称RNA酶H活性)，3’-5’RNA外切酶活性可用于特异降解RNA-DNA杂交分子中RNA部分。3.此酶缺乏起校正作用的3’-5’，DNA核酸外切酶活性，催化的聚合DNA反应会产生一定的错配率。常用的逆转录酶有禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶和Moloney小鼠白血病病毒(mo·MLV)逆转录酶

反转录酶的作用特点：反转录酶的应用：①

将mRNA逆转录为cDNA②

补平和标记5’末端突出的DNA片段的

3’末端③

代替Klenow酶用于DNA序列分析④

以单链DNA或RNA为模板制备杂交探针；⑤

研究RNA的二级结构。五、末端脱氧核苷酸转移酶(末端转移酶)末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeosynucleotidyl

transferase，TdT)多从小牛胸腺中分离出，催化多个脱氧核苷酸依次加到DNA3’末端。末端脱氧核苷酸转移酶的作用特点：1.此酶活性尤以带3’突出的DNA作为受体为佳2.在含有Mg2+、Co2+和Mn2+的低离子强度缓冲液中此酶也能作用于3’平端或5’凹端的DNA分子，若加入嘧啶核苷酸，则以Co2+为首选阳离子；若加入嘌呤核苷酸，则以Mg2+离子为首选阳离子。末端脱氧核苷酸转移酶的作用：末端转移酶常用于给载体或cDNA加上互补的多聚尾巴，构建人工粘性末端；也用于DNA分子3’端标记。六、碱性磷酸酶：碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)来源于大肠杆菌和牛小肠，能水解DNA、RNA以及脱氧核糖三磷酸(dNTP)上的5’磷酸根。碱性磷酸酶应用：①在分子克隆的连接反应中预先处理载体DNA片段，以去除5’-P，防止载体重新自体连接，以提高重组效率；②用32P标记5’末端时，用此酶去除5’-P，再用激酶对5’末端进行同位素标记；③作为化学发光物测定或其他检测系统的指示酶。七、依赖于DNA的RNA聚合酶常用的有噬菌体SP6、T7、T3RNA聚合酶，其中SP6RNA聚合酶来源于SP6噬菌体感染的鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)，T7、T3RNA聚合酶源自大肠杆菌，目前这些RNA聚合酶已能用基因工程的方法大量制备。依赖于DNA的RNA聚合酶功能

SP6、T7、T3RNA聚合酶可以分别识别双链DNA模板上相应的噬菌体特异性启动子，以ATP、GTP，CTP和UTP为原料，沿此双链DNA模板起始RNA的合成．

SP6、T7、T3RNA聚合酶可用于合成单链RNA以作为杂交用探针、体外翻译系统中的功能性mRNA，体外剪接反应的底物；也可以直接用于原核或真核细胞中克隆基因的表达。第二节基因克隆常用载体所谓载体(vecter)是指能在连接酶作用下和外源DNA片段或基因连接，并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。目前用于基因克隆的载体种类繁多，包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌体载体、酵母菌质粒载体以及动、植物病毒载体等

载体必须具备以下基本条件：(1)载体必须有自我的复制子，能借助宿主细胞的复制和调控系统对携带的目的基因进行复制和增殖。(2)载体分子必须具备多种限制性内切酶的识别位点(多克隆位点)，易于外源DNA分子与载体连接及重组。(3)载体及宿主细胞应具有多个利于选择和筛选的遗传表型或标志，包括抗药性、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应等。载体必须具备以下基本条件：(4)载体必须有足够的容量以容纳外源DNA片段，同时载体分子应具有拷贝数高、易与宿主细胞的DNA分子分离并易提取、抗剪切力强等特点。(5)表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件。1．质粒载体：质粒(plasmid)是细菌染色体外的遗传单位，是一种双链环状的DNA分子，大小在1~200kb之间。质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)，能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。

用于基因克隆的质粒载体具有以下特点：

(1)分子较小，一般约数kb左右，比较稳定，具有较高的拷贝数。(2)含有高效的复制子，能在细菌的蛋白质合成受阻，染色质DNA合成停止时，利用细菌的酶系统进行质粒自身的复制。因此在实验中常利用氯霉素以阻止细菌蛋白质的合成，而使质粒的拷贝数增加至数千。(3)质粒具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。

遗传选择标记：

1.氨苄青霉素抗性(ampicillinresistance，ampr)基因：此基因编码ß内酰胺酶，该酶能水解氨苄青霉素ß—内酰胺环，使之失效而使细菌产生耐药。

2.四环素抗性(tetracyclineresistance，tetr)基因：该基因编码一种膜相关蛋白以阻止四环素进入细胞。不同的质粒具有不同的抗药基因，质粒的ampr、tetr基因若被外源基因插入而失活，就失去了耐药性，因此抗药基因常作为基因工程的筛选标志。

遗传选择标记：Ampicillinresistant?yes

yesTetracyclineresistant?NoyesBXBBBXAmproriAmprTcroripBR322AmprTcroriScreeningbyinsertionalinactivationofaresistancegenebackReplicaplating:transferofthecoloniesfromoneplatetoanotherusingabsorbentpadorVelvet(绒布).transferofcolonies+ampicillin+ampicillin+tetracyclinethesecolonieshavebacteriawithrecombinantplasmid3.大肠杆菌LacZ基因：

LacZ基因编码半乳糖苷酶，能分解一种有色基团X与半乳糖以糖苷键结合成的无色化合物X-gal。用含有X-gal的培养基培养细菌时，在细菌的乳糖操纵子(Lacoperon)诱导物异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside，IPTG)的作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，菌落变为蓝色；如果LacZ基因被外源DNA分子插入而遭到破坏，则不能生成相应的半乳糖苷酶，菌落为白色。通过观察菌落的颜色，能方便地进行基因克隆的筛选工作。

遗传选择标记pBR322：pBR322是研究得最清楚应用也最广泛的质粒，全长4363bp，由3种野生质粒成分构建而成，含有Ampr和Tetr两个抗药基因标记，一个复制起始点(ori)，复制子为ColEI。其中ori来自pM9，Ampr来自pRSF2124，Tetr来自pSCl01。在Ampr和Tetr基因中共含有8个限制性酶切位点，以供外源DNA片段的插入。其中在Ampr

基因中的单一酶切位点有PstI、PvuⅡ等；在Tetr基因中的位点有BamHI、HindⅢ、SalI等。

pUCl8／pUCl9

pUC系列质粒是由大肠杆菌pBR质粒和M13噬菌体改建而成的质粒载体。全长2674bp，具有氨苄青霉素抗性基因，一个复制起始点，复制子为ColEI。pUC系列质粒带有一段大肠杆菌Lac操纵子DNA片段，能编码β-半乳糖苷酶氨基端的一部分，同时与大肠杆菌的gal-基因互补。当pUC质粒转化到gal-的宿主菌后，在含有诱导物IPTG和生色底物X-gal的培养基上形成蓝色菌落；如果外源DNA片段克隆到pUC的Lac基因区域时，造成Lac基因失活，在含有IPTG、X-gal的培养基上将生成白色菌落。Recreatedvector:bluetransformantsRecombinantplasmidcontaininginsertedDNA:whitetransformantsRecreatedvector(noinsert)Recombinantplasmid(containinsert)pUCl8／pUCl9的应用pUCl8／pUCl9在结构和组成上基本一致，但相对于LacZ启动子的多克隆位点中的限制性酶切位点互为相反的方向排列。

2．λ噬菌体

1.λ噬菌体的基因组DNA长度约为50kb，基因组比较复杂，共含有66个基因。从λ噬菌体颗粒中分离出的DNA分子为双链线状，在其末端分别具有突出的12bp的互补单链，是天然的粘性末端，称为COS位点。当感染细胞后，λ噬菌体借COS位点互补连接形成双链环状结构，并按造θ方式和滚环方式复制。2.λ噬菌体感染细菌后可进行裂解性生长和溶源性生长。

λ噬菌体作为载体具有两个特点：

1.

λ噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌体基因组中央含有约30％的DNA是λ噬菌体生长所非必需的。2.λ噬菌体的成熟需要经过包装,当与外源DNA片段重组后的大小介于原来的78％一105％之间时，重组的DNA分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒。

λ噬菌体载体类型：1.置换型载体(replacementvectors)：允许外源DNA片段代替自身的生长非必需区，这种克隆方式容纳的外源DNA片段可达30kb。2.插入型载体(insertionvectors)：允许克隆的外源DNA片段较小，一般为7kb以下。目前已构建了大量的λ噬菌体载体，例如Charon系列、λgt系列、EMBL系列等各种类型的载体。以下将λgt

ll作为插入型及表达型载体予以具体介绍。λgt11：长43700bp，改造后含有LacZ片段，克隆位点是EcoRⅠ，位于LacZ的羧基端，插入的外源片段可达7kb，当插入的外源基因与LacZ基因阅读框相符时，能产生β-半乳糖苷酶与外源蛋白的融合蛋白，可以用蛋白质印迹分析进行检测。同时重组的λgt11因LacZ基因的失活，在X-gal培养基中形成白斑，而未重组的λgtll形成蓝斑，十分容易区分。M13噬菌株载体：

M13噬菌体是一种丝状噬菌体，全长为6407bp，呈闭合环状并以正链单链DNA(single—strandedDNA，ssDNA)形式存在于噬菌体颗粒内。M13只感染具有F伞毛的雄性大肠杆菌。

M13感染大肠杆菌（ssDNA）

酶

RFDNA(双链复制型

)（可用作基因克隆的载体

）RFDNA拷贝数达到100～200个后

只合成单链正链DNA包装成为成熟的噬菌体颗粒并从细菌体内溢出。

一、应用：1.用双脱氧链终止法进行DNA序列测定2.制备仅有一条链得到放射性标记的杂交用DNA探针3.利用寡核苷酸进行定点诱变。M13噬菌株载体M13噬菌株载体：二、特点：1.对外源DNA的插入无长度的限制

RFDNA作克隆。2.常用载体M13mp18/M13mp19—

蓝白斑鉴定4.病毒载体：在目前广泛使用的各种真核病毒载体中均含有各种相似的调控序列，包括DNA在真核细胞中的复制起始点、启动子、剪切位点、多聚腺苷化信号、增强子等。下面介绍几种常用真核细胞病毒载体。反转录病毒载体(retrovialvector)反转录病毒(retrovirus)是一种RNA病毒，基因组全长8～10kb，该RNA有mRNA的功能，其5’端是甲基化帽子结构，3’端是Po!yA尾巴。逆转录病毒一般含有3个基因：结构蛋白基因(gag)、逆转录酶基因(po1)、糖蛋白基因(env)另外，许多逆转录病毒还含有一个癌基因(onc)能转化感染细胞。在逆转录病毒基因组的两端分别有一个长末端重复序列(1ongterminalrepeat，LTR)，其中含有启动子、增强子、整合信号及多聚腺苷化信号等调控序列。逆转录病毒载体：通过基因工程改造，使病毒载体成为只有一次感染能力的重组RV载体。

逆转录病毒用作载体时需进行的改造：

（1）将天然的野生型RNA前病毒转变成DNA载体，并插入欲转移的相关外源基因。其基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因。（2）制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能。（3）将载体DNA导入辅助细胞以产生有感染力的病毒载体。（4）病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达。反转录病毒载体的优点：①是具有穿透细胞的能力，可使近100％的受体细胞被感染，转化细胞效率高；②它能感染广谱动物物种和细胞类型而无严格的组织特异性；③随机整合的病毒可长期存留，且单拷贝、单位点，很少发生重排；一般无害于细胞，④可包装10KB外源基因反转录病毒载体缺点：①这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体，而不适合于那些不能正常分裂的细胞，如神经元。②最严重的问题是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。③操作较复杂操作过程：

目的基因+有缺陷的逆转录病毒↓重组DNA装入质粒↓导入辅助细胞↓分泌有感染力的病毒颗粒↓感染宿主细胞↓培养2~3天↓筛选①

卸甲载体(disarmedvector)，以用完整的反转录病毒双链DNA为载体，将外源DNA片段取代反转录病毒中的癌基因，这样的载体就称为卸甲载体。目前已构建的反转录病毒载体有两种②

穿梭载体(shuttlevector)，这是一种既能在原核细胞又能在真核细胞中复制和表达的载体，由反转录病毒的LTR、包装信号和质粒的复制起始点、筛选元件等成分重组而成。由于此类载体缺乏逆转录病毒的结构基因，需要野生病毒提供结构蛋白，以形成有感染力的重组体。目前此类载体已成为表达外源基因的重要基因工程载体。1.用反转录病毒作为载体需要相应的包装细胞，以形成完整的体系。2.包装细胞提供结构蛋白，与带有外源基因的重组反转录病毒载体分子一起生成能高效感染靶细胞的病毒颗粒。反转录病毒载体的作用：反转录病毒载体的作用：目前常用的反转录病毒载体有多种，例如经Moloney小鼠白血病病毒(Mo-MLV)改造构建成的载体，其宿主广泛，传染率极高，是目前最常用的反转录病毒载体。包装细胞也有多种，均由稳定的小鼠成纤维细胞系或QT6鹌鹑细胞系衍生而来，如第一代的ψ-2、ψ-am；第二代的PA3l7；新一代的ψCRIP，原则上包装细胞应避免产生具有复制力的野生型病毒。SV40(Simianvirus40)(猴肾病毒)载体

SV40是一种小型球状病毒，其基因组为共价闭合环状双链DNA，长5243bp，基因组分为早期和晚期两个功能区，编码5种蛋白质，包括维持细胞转化状态的大T抗原等成分。SV40病毒颗粒可直接作为克隆载体使用，外源DNA以置换的方式取代SV40的晚期区和早期区形成重组体。

但这种克隆方法存在许多缺点，例如载体容量小、感染宿主有限(仅限于猴细胞)等，因此目前已对其进行了相应的改造，衍生出一系列的SV40载体，它们均含有SV40复制起始点、一个宿主广泛的启动子和多聚腺苷化信号，还含有拼接供体和受体信号。因此SV40衍生载体能在多种哺乳动物细胞中表达，尤其是在COS细胞中高效表达；对基因组DNA和cDNA均能表达，对插入的外源基因大小无限制。

目前常用的SV40衍生载体有pSVT7、pMT2等，它们都可进行外源基因的瞬时表达，广泛用于基因表达研究的各个领域。

昆虫病毒载体：

目前最常用的昆虫病毒载体是杆状病毒载体系统。

杆状病毒(baculovirus)是一种大型、有包被的双链DNA病毒，主要感染节肢动物。

杆状病毒载体作为在真核细胞中表达蛋白的系统应用广泛。其特点为：①杆状病毒载体系统是真核表达系统，在真核细胞中可以直接进行蛋白的修饰和加工；2.杆状病毒载体系统的重组区是病毒生长非必需区，在培养的昆虫细胞中可获得高滴度的重组病毒及相应的蛋白产物，而且表达的蛋白质多数可溶；3.杆状病毒基因组较大(130kb)，可插入的外源DNA片段较大(>100kb)；4.杆状病毒载体含有一个强包含体蛋白启动子，能启动克隆于其下游的基因高效表达；5.杆状病毒不感染脊椎动物，病毒启动子在哺乳动物细胞中无活性，用于表达癌基因或对人体有毒的蛋白质时比较安全；6.如果杆状病毒载体的包含体蛋白基因区插入有外源基因时，包含体基因缺失，培养条件下失去包含体蛋白的病毒空斑与野生型病毒空斑形态不同，容易区分。酵母人工染色体载体：酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)载体可克隆和分离的DNA片段达l000kb。由于YAC系统作为载体其容量可达数百kb甚至1Mb，故能保持克隆基因的完整性，而且利用YAC构建人类的基因组文库，只需数千个重组体即可满足需要。

YAC包括以下调控元件：(1)着丝粒(centromere)，以保证染色体在分裂过程中能正确分配到子代细胞。(2)端粒(telomere)，作为染色体复制所必需的成分，能防止染色体被核酸外切酶降解，(3)复制起始点、限制性酶切位点和筛选标记。(4)原核序列及调控元件，包括大肠杆菌复制起始点、Ampr基因等，以利于在大肠杆菌中操作。重组DNA技术的基本过程第三节目的基因的分离与制备第四节目的基因的体外重组第五节重组子导人宿主细胞第六节阳性重组子的筛选和鉴定第三节目的基因的分离与制备一、通过基因组文库分离、筛选基因二、cDNA文库分离、筛选基因三、人工合成基因四、应用聚合酶链反应获取目的基因一、通过基因组文库分离、筛选基因基因组文库(genomiclibrary)是指用基因克隆的方法保存在适当宿主中的DNA重组分子的集合，所有重组子所含的插入片段的总和代表某种生物基因组全部核酸序列。基因组文库的构建是将细胞中的基因组DNA切割成一定大小的片段，与合适的载体(λ噬菌体、质粒、YAC系统等)进行重组，并转化宿主细胞。在进行任一基因筛选时达到99％以上的概率，这种方法类似于霰弹打鸟，因此也称为鸟枪法。要从如此庞大的文库中筛选出某一特定基因十分困难，尤其是单拷贝基因。随着分子生物学技术的发展，如分子杂交及探针技术的应用等，从基因组文库中筛选出特定基因已无大的困难二、cDNA文库分离、筛选基因

cDNA文库(cDNAlibrary)是指利用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的群体，每一重组子只含一种mRNA信息，这些重组子的总和包含某种生物的全部mRNA序列。

cDNA文库是以mRNA为模板在逆转录酶的作用下合成cDNA，与合适的载体重组并导入宿主细胞而形成的。cDNA文库中的插入片段是由mRNA逆转录生成，可直接指导转录和翻译也就是说针对不同的组织或细胞所建立的cDNA文库代表各自特定的mRNA表达谱，例如要制备胰岛素的cDNA只能用从胰岛素细胞中提取的mRNA建立的cDNA文库中筛选。

三、人工合成基因：

知道目的基因的结构与核苷酸序列及其他相关的基因信息。对于短片段(20～30bp)的合成效率较高，对于较长的基因片段的合成，必须先按照已知的DNA序列将其划分为较短的片段，由合成仪逐一合成再拼接成大片段。

四、应用聚合酶链反应获取目的基因

1.选择不同的DNA分子为模板，通过PCR扩增以获取包括外显子、内含子以及相应调控元件的完整基因片段；2.还可以用RNA分子为模板，通过逆转录PCR扩增生成cDNA以获得大量的不含内含子及调控序列，只含有结构基因的DNA片段。3.通过PCR技术获取的DNA片段可直接用于后续的基因克隆、探针制备、cDNA文库的建立等众多的分子生物学研究中。第四节目的基因的体外重组

DNA分子的体外重组:是DNA分子之间的连接过程。这是一个DNA连接酶催化的生物化学反应。几种常用的DNA分子连接方法

1．粘性末端连接法(cohesiveendligation)2．平头末端连接法(bluntendligation)3．人工接头法(artificallinker)4．同源多聚尾序(homopolymerictails)连接法

1．粘性末端连接法(cohesiveendligation)

这种方法适用于插入片段和载体分子具有相同的粘性末端(cohesiveend)，相同的粘性末端在DNA连接酶的作用下很容易重新连接在一起。

II类限制酶一般识别长度为4个或6个呈二重对称的核苷酸特异序列粘性末端连接法存在以下几点缺陷：(1)高背景，即存在一定数量的载体自身环化分子

(2)双向插入。可采用定向克隆方式，即对载体和插入片段均使用两种内切酶进行处理。(3)多拷贝插入，将造成表达困难。适当调整插入片段与载体分子的比例能减少多拷贝插入的产生，一般采用2：1(插入片段摩尔数：载体摩尔数)1.去除5`端磷酸基团以防止载体自身环化连接。2.对于双向插入应采用内切酶图谱对阳性重组子进行筛选；3.对于多拷贝插入问题应加大T4DNA连接酶浓度、降低ATP浓度、载体去磷酸化等措施以尽量减少其可能性。

2．平头末端连接法(bluntendligation)

平头结构，在T4DNA连接酶的作用下同样能进行连接。但是这种连接方式的效率较低。这时应适当增加酶量，提高反应中底物的浓度并延长反应时间。

3．人工接头法(artificallinker)

人工接头主要用于在DNA分子的平头末端上添加新的内切酶位点以产生粘性末端，以提高连接效率。人工接头大小一般为8—12个碱基对。4．同源多聚尾序(homopolymerictails)连接法

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）能催化脱氧核苷酸逐个添加到单、双链DNA分子的3’-OH末端上。目的DNA分子与载体分子可通过多聚尾巴的同源互补连接在一起。末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的最适底物是具有3’端突出的双链DNA。

同源多聚尾序连接法要求DNA分子内部必须完整，即两个DNA链间不存在缺口；否则末端脱氧核苷酸转移酶也会在3’-OH上加入多聚尾巴，破坏了DNA分子活性。另外，由于在重组分子中加入了新的核苷酸序列，从而影响了DNA片段表达的真实性，而且外源DNA片段一般难以从载体上完整切下并回收。

二、定向克隆：定向克隆是指将外源DNA片段定向插入到载体中的方法。要做到定向插入则要求载体DNA分子的两端不能互补，同时外源DNA分子的末端是不相互补的粘性末端，或者一端为粘性末端，另一端为平头末端。

第五节重组子导入宿主细胞体外重组生成的重组子必须导入到合适的宿主细胞中才能进行复制、扩增和表达。宿主细胞分为两种：原核细胞和真核细胞。

质粒DNA分子或以质粒为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程称为转化(transformation)。通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程称为转导(transduction)。转染：是由转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动或被动导入外源DNA的过程。

细胞DNA转化原核细胞质粒感染（转导）原核细胞噬菌体转染真核细胞质粒、病毒感受态细菌(competentcell):

系指利用理化的方法人工诱导细菌，使之处于易于吸收和容纳外源DNA分子的状态，这时的细菌就称为感受态细菌。（一）感受态细菌的制备：1.用冰预冷的CaCl2处理细菌：即用低渗CaCl2溶液在0℃时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。2.此时细菌膨胀成球型，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细菌表面。（二）DNA进入细胞：3.通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。4.然后将细菌接种于含相应抗生素的培养基上，含有重组子的感受态细菌将形成单菌落。5.这时可挑选单菌落进行相应的筛选及鉴定分析。

二、λ噬菌体转染受体细胞

λ噬菌体能将自身的DNA分子注入到宿主细胞内，这是λ噬菌体作为载体具有较高转染效率的主要原因。但前提是DNA分子必需被λ噬菌体的蛋白包装，并形成成熟的噬菌体颗粒以后才能完成感染过程。因而应用λ噬菌体载体转导外源DNA必须先完成体外包装。

体外包装(invitropackaging)是指在离体条件下，将提取的包装蛋白与带COS位点的DNA混合，产生噬菌体颗粒的过程。λ噬菌体及粘粒载体一般须经包装蛋白体外包装，再感染大肠杆菌将DNA转移进宿主。通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程称为转导(transduction)，而通过转导接受外源DNA的细胞称为转导子(transductant)。

第六节阳性重组子的筛选和鉴定

一、根据遗传表型筛选

二、应用限制性内切酶酶切分析筛选

三、核酸探针筛选

四、PCR筛选

五、菌落原位杂交技术

一、根据遗传表型筛选

1．抗生素平板筛选2．互补筛选3．插入表达筛选4．噬菌斑筛选

1．抗生素平板筛选大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入载体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。但是除阳性重组子以外．自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的基因插入载体形成的重组子均能转化细胞而能生长，故本法仅是阳性重组子的初步筛选。同样还可应用插入失活双抗生素对照筛选法，在含有两个抗药性基因的载体中，通过插入插入失活其中一个基因，可用两个分别含有同药物的平板对照筛选阳性重组子。如pBR322质粒含有Tetr、Ampr双抗药性，插入失活Tetr后，Tet

r

、Ampr为含载体的阴性菌落，Tet

-

、Ampr表型的菌落为阳性，Tet

-

、Amp