三聚氰胺事件案例分析

三聚氰胺事件案例分析事件概况2008年中国奶制品污染事件（或称2008年中国奶粉污染事故、2008年中国毒奶制品事故、2008年中国毒奶粉事故）是中国的一起食品安全事故。事故起因是很多食用三鹿集团生产的奶粉的婴儿被发现患有肾结石，随后在其奶粉中被发现化工原料三聚氰胺。根据公布数字，截至2008年9月21日，因使用婴幼儿奶粉而接受门诊治疗咨询且已康复的婴幼儿累计39,965人，正在住院的有12,892人，此前已治愈出院1,579人，死亡4人，另截至到9月25日，香港有5个人、澳门有1人确诊患病。事件引起各国的高度关注和对乳制品安全的担忧。中国国家质检总局公布对国内的乳制品厂家生产的婴幼儿奶粉的三聚氰胺检验报告后，事件迅速恶化，包括伊利、蒙牛、光明、圣元及雅士利在内的多个厂家的奶粉都检出三聚氰胺。该事件亦重创中国制造商品信誉，多个国家禁止了中国乳制品进口。9月24日，中国国家质检总局表示，牛奶事件已得到控制，9月14日以后新生产的酸乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳等主要品种的液态奶样本的三聚氰胺抽样检测中均未检出三聚氰胺。2010年9月，中国多地政府下达最后通牒：若在2010年9月30日前上缴2008年的问题奶粉，不处罚。2011年中国中央电视台《每周质量报告》调查发现，仍有7成中国民众不敢买国产奶。蛋白质检测方法蛋白质的理化性质及反应众多，光是显色反应就达十余种，每一种或一类性质就意味着一条检测途径，因此能够用于检测蛋白质的方法多种多样。在众多的蛋白质含量常规检测方法当中，历史最长、最为成熟的两种方法是基于氮元素含量测定的凯氏定氮法和燃烧定氮法；发展速度最快、无需样品预处理的快速检测方法首推近红外光谱法；应用最为广泛、实现最为灵活的是基于显色反应的比色法；能够对不同结构和大小的蛋白质分子进行分离检测的主要有高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳。此外，还有其它一些不常用或是非常规的方法也可用于蛋白质含量的检测。1凯氏定氮法凯氏定氮法是丹麦化学家Kjeldahl于1883年提出的，历经一个多世纪的发展后已逐步趋于成熟和完善。Kjeldahl发明凯氏定氮法的最初目的是检测啤酒原料谷物中蛋白质的含量，后经多次改进检测过程不断简化、检测结果的重现性和可靠性逐步提高，最终被人们所广泛采用。目前凯氏定氮法已成为众多国家和组织机构检测蛋白质的标准方法，被各领域学者和研究人员应用于蛋白质的检测之中。

1.1凯氏定氮法的测量原理

凯氏定氮法主要基于蛋白质中氮元素含量大致为16%这一原理，虽然在不同的时期具体实现细节上略有不同，但大致都分为消化、蒸馏和滴定三大步骤。

“消化”的作用是将氮元素从被测样品中分离出来。其基本原理是含氮有机化合物在高温浓硫酸中被氧化为CO2、H2O、NH3以及一些其他相关化合物，产生的NH3进一步与H2SO4作用生成(NH4)2SO4。由于有机化合物在高温浓硫酸中的分解过程十分缓慢，通常加入K2SO4或Na2SO4或来增大浓H2SO4的沸点，以此提高反应的温度。此外还需加入CuSO4作为催化剂，进而缩短“消化”时间。目前大多数文献和标准方法中均以Cu作为催化剂（Cu和H2SO4反应生成CuSO4），消化时间为120分钟左右，消化温度为160～420℃之间。

“蒸馏”的作用是将氨从消化产物(NH4)2SO4中分离出来。其基本原理是(NH4)2SO4遇浓碱（大多用NaOH）分解为Na2SO4和NH4OH，加热后NH4OH从溶液中挥发出来分解成水蒸气和游离的NH3，为了防止NH3的扩散流失用一定浓度的硼酸（H3BO3）溶液吸收蒸气，H3BO3与蒸气中的NH3结合生成碱性的NH4H2BO3（NH4+和H2BO3–）。蒸馏是凯氏定氮法中较为关键的步骤，实验操作的准确性、游离NH3的蒸发效率及吸收程度直接决定着检测结果的重现性和准确度。

“滴定”用于对溶液中的铵离子（NH4+）进行定量。其基本原理是NH4H2BO3与强酸反应生成中性的铵盐和H3BO3。一般采用标准浓度的HCl或H2SO4对NH4H2BO3溶液进行滴定，根据消耗HCl或H2SO4的量计算出氨的含量，进一步折算成氮的含量以后根据蛋白质中氮元素的比例，最终推算出被测样品中蛋白质的含量。1.2凯氏定氮法的优点和局限性

凯氏定氮法之所以能历经一百二十多年仍在广泛流传主要是因为它具有应用范围广、重现性好、准确度高、灵敏度高、样品用量少等众多优点。从国内外的研究与应用现状可以看出，不论被测样品是固体、溶液、或是浑浊液凯氏定氮法都能适用；对同一样品的多次测量的重现性好、平行度高，平行误差极小；检测限低、灵敏度高，对氮的最低检测限低于50ug。

同样从国内外的研究和应用状态也可以看出，凯氏定氮法主要局限于样品中总蛋白的检测。从凯氏定氮法的基本原理可以看出，“消化”其实质是一个氧化过程，除了蛋白质以外，其它能被浓硫酸氧化的含氮化合物在消化的过程中也会产生(NH4)2SO4，即凯氏定氮法测量的是总有机氮。因此凯氏定氮法测量总蛋白时极易受到被测样品中其它有机含氮化合物的干扰，例如被测样品中含有尿素、碳酸铵、氯化铵等物质时检测结果就不准确[1]，据说当年的三鹿公司就是采用凯氏定氮法来检测原料奶中蛋白质的含量，而没能检出原奶中添加的三聚氰胺[2]。要去除非蛋白氮的干扰，一般先添加三氯乙酸等溶液将蛋白质变成沉淀过滤掉[3]，然后再次采用凯氏定氮法或其它的方法测量出滤液中的非蛋白氮，扣除掉非蛋白氮的含量以后才能得到被测样品中总蛋白的含量。

由于构成蛋白质的氨基酸的含氮量不尽相同，将氮元素的含量折算成蛋白质的含量时折算系数选择不当也会带来较大的误差。例如小分子量氨基酸、碱性氨基酸和氨基酸酰胺的含氮量高于氨基酸的平均含氮量，这样的氨基酸含量较大时会导致折算出的蛋白质含量比实际值偏高。

此外，凯氏定氮法的操作略显繁琐，测量时间比较长，不利于对大批量样品的快速测量。2燃烧定氮法燃烧定氮法是法国化学家Dumas于1831年首创的一种含氮化合物的定量检测方法，经Erdman和Schitt改进后逐渐成熟。早期的燃烧定氮法只能测量几毫克的样品，直到1989年德国的贺利氏（Heraeus）公司生产出可以测量克级样品的杜马斯快速定氮仪，燃烧定氮法才在食品、饲料、土壤、临床等各个领域广泛应用起来。

2.1燃烧定氮法的测量原理

早期的燃烧定氮法由“燃烧”、“还原”、“净化”、“检测”四个环节组成。经过一百多年的发展后，总结近10年来的相关文献，结合当前分析仪器界先进的测控手段和成熟的检测技术，现代化或是未来的燃烧定氮仪分为“燃烧”、“净化”、“分流”、“还原”、“分离”、“检测”六个步骤，其结构如图1.2所示，荷兰Skalar公司生产的PrimacsSN型“总氮—蛋白质分析仪”就是采用类似的结构。“燃烧”是将被测样品氧化消解的一种化学反应过程。燃烧炉的温度一般为900～1200℃，助燃气为高纯氧气，进样后被测样品在炉内高纯氧气中剧烈燃烧，产生H2O、CO、CO2、N2O、NO、N2O3、NO2、N2O4、N2O5以及硫、磷、氯等其它少量或微量含氧气体。为了使氧化更加充分、使不稳定的含氧气体转化为更加稳定的含氧气态物质，一般在燃烧炉后加装一个温度略低、充满催化剂（如氧化铜）的催化炉，使燃烧变得更加高效和充分。经过催化炉后燃烧产物气体仅有H2O、CO2、NO2以及少量或微量的其它含氧气体。“净化”和“分离”的作用在燃烧定氮法中既有重叠的地方，也有各自的不同之处，二者相互补充。正因为如此，这两个部分是燃烧定氮法中最为灵活之处，没有统一的标准。“净化”的作用是除去H2O、盐类、以及含硫磷等成分的干扰气体；“分离”的作用既可以是去除干扰气体，也可以是使不同的气体物质在不同的时间到达同一检测器或是在同一时间到达不同的检测器进而消除物质间的相互干扰。去除干扰气体可以使用五氧化二磷、高氯酸镁、碳酸钠以及铬酸盐等固体颗粒吸附剂；除水蒸汽既可以使用吸附剂，也可以采用电子制冷等物理方法；改变不同气体物质到达检测器的时间可以使用气相色谱法或是离子迁移谱；使不同的气体到达不同的检测器可以使用选择性电离源。若“分离”采用气相色谱等能消除不同气体之间相互影响的方法，则“净化”的功能可以减弱，只需要除去H2O和其它少量难以分离的物质即可。

“分流”的作用是按一定比例释放过量的燃烧产物气体，以达到增大测量动态范围的目的。常规的燃烧定氮法只能测量毫克级的样品，对燃烧产物气体分流后可将测量样品提高至克的级别甚至更高，从而极大地拓展其在农产品等领域的应用。

“还原”的作用是将NO2及少量的其它氮氧气体转换成易于净化和检测的N2。要实现有选择性地还原，还原剂的还原性不能太强，也不能太弱，常用的还原剂有铜、钨等金属粉末或颗粒。当“分离”部分的功能比较强大使得后续检测器能精确地检测出各种不同的气体时，“还原”部分可以省略，例如通过GC-MAS进行分离和检测，可以通过NO2及其它含氮化合物的总量换算出蛋白质的含量。“检测”的作用是将氮的含量转变为可量化的电信号。当前燃烧定氮法采用的主流检测器为热导检测器（TCD），该检测器由热导池和惠斯顿电桥组成，利用被测样品组分与高纯载气热导系数不同引起电桥两臂电势差的改变来将被测气体的浓度转变为电信号。TCD检测器是一种通用型检测器，几乎对所有的气体组分都有响应，但其灵敏度略差，线性范围窄。除了TCD检测器外，氮磷检测器（NPD）、电子捕获检测器（ECD）、以及其它一些电离型离子探测器亦可用于燃烧定氮法。2.2燃烧定氮法的优点和局限性

从测量原理上看，燃烧定氮法只需要使用助燃气（高纯氧气）及载气（如氦气等）两种气体，不需要类似于凯氏定氮法的大量化学试剂，省去了添加试剂、试管清洗等众多的人工操作，测量速度快，比较适合做成自动化程度较高的无人看管型分析仪器，既清洁环保，又节省人力。从测量范围上来看，燃烧定氮法测量的主要是毫克级的样品，属于微量分析，检测限也相对较低，测量结果的重现性也好于凯氏定氮法，可用于精密的测量与检定。由于具有快速、高效、精准等优点，燃烧定氮法得到了发达国家蛋白质检测相关标准及国内外比较有经济实力的科研与检疫机构的广泛青睐。

虽然燃烧定氮法在检测限、测量精度、测量速度、操作便利程度等方面有着显著的优点，但从国内外的研究与应用现状来看，在漫长的历史发展过程中其使用与普及的程度远不如凯氏定氮法，这与它自身的一些局限性密不可分。

首先，燃烧定氮法对原理中各环节的实验装置要求较高，非普通的科研及实验人员能够自行搭建，购买商品化的燃烧定氮仪几乎成了现今应用开发者的唯一选择，30—100万元人民币一台的价格成为燃烧定氮法推广与普及的主要障碍。这也是燃烧定氮法在欧美等发达国家能被众多检测标准所采用，我国等中等发达国家只被少数检测标准采纳或是仅定为参考检测方法的重要原因。其次，燃烧定氮法测量的是总氮，不能区分有机氮和无机氮，更不能区分被测样品中的蛋白氮和非蛋白氮。燃烧定氮法比较适合于成分简单的纯净样品中蛋白质的检测，而人为掺假、制假的样品会给其带来误导性的信息，给测量结果带来较大的误差。

此外，从燃烧定氮法的检测过程来看，其测量的是相对氮，检测到的电信号需要与标准曲线进行比对才能换算出含氮量或蛋白质的含量，测量前需要进行多个空白样品和标准样品的检测[4]，定标的准确性直接影响到测量的准确性，且由于准备工作较多导致单次检测成本高，不利于少量样品的检测。测量过程中需要持续不断地通入纯净的助燃气和载气也制约着燃烧定氮法从实验室走向检测现场。3近红外光谱法近红外光谱法是近年来发展较为迅速的一种快速无损测量方法，该方法最初被农业研究人员用来分析种子和谷物中的水分、蛋白质、油脂、灰分、纤维素等，现已广泛应用于农业、食品和饲料加工等行业中。

3.1近红外光谱法的基本原理

当红外光照射样品分子时，异核双原子组成的偶极子（极性共价键）选择性地吸收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500~25000nm的中红外区域，发生在780~1100nm的短波近红外区和1100~2500nm的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频和组合频。3.2近红外光谱法的优点和局限性

从近红外光谱法的基本原理可得，近红外光谱具有非常丰富的结构和组织信息，绝大多数的有机物都有吸收响应，所以测量时几乎无需进行样品前处理[5]，极大地简化了蛋白质的测量过程，使得其具有不破坏样品、不用试剂、测试方便、测量速度快、对实验人员要求低等众多优点。这也是近些年来近红外光谱分析法发展火热的主要原因。此外，随着近年来光、电器件的快速发展，光谱仪器的成本大幅降低，使得近红外光谱法对蛋白质的测量从实验室走生产质量监控和快速检测现场成为可能。

同样，从近红外光谱法的基本原理可知，近红外光谱的吸收系数小，其检测限通常不到0.1%，不利于对蛋白质的衡量分析。此外，由于是含氢基团基频振动的倍频和组合频吸收，近红外光谱鲜有尖锐和基线分离的谱峰，大量的宽谱带重合在一起[5]，需要借助数学方法建立可靠的分析模型将有用信息提取出来。而建立一个稳健可靠的数学分析模型需要事先测量大量的样品。4比色法

在蛋白质的众多检测方法当中比色法下属分支最多，使用最为灵活。每新增一种成熟的显色剂，就增加一个新的测量分支，也意味着一种新的测量方法。虽然该方法下属分支方法的显色反应互不相同，但大体的测量原理基本一样。

4.1比色法的测量原理

比色法是基于蛋白质与显色剂的显色反应的一类光学测量方法。蛋白质与显色剂反应形成对某种波长光子具有较强吸收而呈现出另外一种颜色的产物，对该波长的吸收程度以及新颜色的深浅与蛋白质的浓度相关。显色比色法正是基于这一原理，因此其测量原理可分为显色反应和比色测量两大步骤。

比色的主要任务是通过对显色后的光信号进行测量，最终定性、半定量或定量得出蛋白质的含量。不同的显色方法对应的比色手段却基本相同。精确比色一般采用分光光度计；在已知吸收波长的专用检测中也可使用滤光片替代分光光路，或是采用与吸收波长一致的窄带单色激发光源；在要求不严格的定性检验中比色也可借助自然光使用目测的方式来完成。

显色反应的作用是将蛋白质含量的信息转化为易于测量的光信号。显色比色法的检测限、测量精度、稳定性主要受显色结果的影响。蛋白质的显色反应丰富多样，理论上这些能与蛋白质发生颜色反应的物质都可用于蛋白质的测量，但考虑到显色结果的稳定性、灵敏度以及显色物质是否有毒或是污染环境，仅有一部分物质适合作为显色剂。目前使用较多的显色剂有双缩脲试剂、Folin-酚试剂、BCA试剂、考马斯亮蓝以及茚三酮。5高效液相色谱法高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）诞生于上世纪40年代，在60年代高效填料出现以后开始迅速发展，如今已在化学、医学、工业、农学、商检和法检等众多领域中广泛应用。5.1高效液相色谱法的基本原理

色谱是一种利用组分在两相中的热力学分配系数和动力学扩散系数差异来实现混合组分分离的物理化学分析技术。两相中的一相是表面积很大的固定床，通常称为固定相；另一相是携带样品组分渗析通过固定床的流动载体，通常称之为流动相。由于不同的物质的溶解度、蒸汽压、吸附能力等物理化学性质存在差异，它们在流动相和固定相之间的分配系数有所不同，当两相做相对运动时样品组分在两相之间进行多次连续分配，最终实现各组分的彼此分离。

高效液相色谱法以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的毛细管色谱柱，在柱内各成分被分离后进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。相应的检测仪器一般由“储液瓶”、“输液泵”、“进样器”、“色谱柱”、“检测器”等5部分组成。高效液相色谱法有正相和反相之分，采用极性固定相的称为正相高效液相色谱（PP-HPLC或HPLC），采用非极性固定相的称为反相高效液相色谱（RP-HPLC）。在蛋白质的分离与分析过程中，常用的是反相高效液相色谱。5.2高效液相色谱法的优点和局限性

高效液相色谱法具有分离柱寿命长、分离效率高、分析时间短、进样量小、检测灵敏度高等众多优点[6]，因此在众多的领域中被广泛采用。用于蛋白质检测时的主要局限性是对组成单位相似、分子极性相近、分子大小不同的动植物蛋白组分分离效果不佳。此外，高效液相色谱法的流动相复杂，容易引起环境污染，检测成本以及仪器维护费用高。6毛细管凝胶电泳法毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresis,CGE）由Hjerten于1983年提出，它是一种具有极高分离度的液相分离技术，经过近30年的发展已成为医学及生命科学等前沿领域重要的分析手段和检测方法。

6.1毛细管凝胶电泳法的基本原理

电泳也称作电迁移，是指溶液中带电粒子在电场中所发生的迁移运动，运动的迁移率与组分分子的大小、极性、亲和能力、等电点、相分配系数以及所带电荷的多少等多个因素有关。毛细管电泳又称为毛细管电分离，是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力、根据带电粒子迁移率的不同来实现组分分离的一种液相分离技术。

在毛细管内充满凝胶介质的电泳称为毛细管凝胶电泳。电泳过程中，分子在电场作用下发生电泳迁移时会受到网状凝胶的阻碍作用，大分子受到的阻碍作用大，迁移速度较慢；小分子受到的阻碍作用小，迁移速度较快；不同大小的分子由于迁移速度不同最终被分离，细管凝胶电泳便是基于以上原理。聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、HydroLink胶等物质可以作为毛细管凝胶电泳的凝胶介质。6.2毛细管凝胶电泳法的优点和局限性

毛细管凝胶电泳法最突出的优点是分离度极高，其分离塔板数可达107/m以上。此外，它还具有分离速度较快（分离时间为几十分钟）、样品消耗量少（进样量为nL级）等优点。毛细管凝胶电泳法的最大局限性是分离检测成本高，这也是它应用于普通行业和领域的主要障碍。此外，其分离柱制备麻烦、使用寿命短，大分子容易积留、清洗困难，重现性也有待改善。非法添加的驱动原因2000年后，因为我国经济的迅速发展，乳制品市场转变成一个很大市场，且因巨大消费群体，更可划分为高、中、低三个消费层次。为了调节大陆市场供应与需求，除了从海外的日本、新西兰等国进口将近30万吨乳制品以应付高中消费层次外，中国大陆绝大多数消费群体，包括婴幼儿，还是以我国自主生产的产品为主。在此因素下，知名三鹿牌顺势推出以一袋18元人民币（约3美金），不到进口奶粉价格一半价格婴幼儿配方奶粉以应付大规模的奶业市场，之后并成为大陆重要且知名婴幼儿奶粉品牌，多年蝉联该中国大陆自制乳品市场的首位。不过因为需求甚殷，价格竞争等因素，公司与政府均漠视生产流程及质量控管，终于爆发此弊端漏洞。虽然经相关单位调查后，我国大陆检察机构认为该污染事件应由乳品收购站负主要责任，并严惩逮捕相关当事人。不过，也有人质疑，该毒奶粉事件原因是三鹿集团抢夺大陆贫穷农村市场，为降低成本偷工减料所衍生出来。事件后果2008年9月12日三鹿集团声称，此事件是由于不法奶农为获取更多的利润向鲜牛奶中掺入三聚氰胺。三聚氰胺在一份报价单中的价格为每吨8700元。早在2008年7月中旬，就有记者就从三鹿品牌甘肃省总经销商——兰州兴源食品公司了解到三鹿已经停止生产确认受到三聚氰胺污染的奶粉品牌三鹿优加奶粉，2008年9月12日网易财经编辑从三鹿品牌总监处得到确认，2008年8月5日就通知各地经销商，三鹿在3月至2008年8月5日之前生产的产品受到污染，停售优加系列产品，并且秘密召回，但未公诸于众。这导致在此后的一个多月里，又有一批婴儿仍食用了三鹿问题奶粉。三鹿集团官方网站在事件曝光后遭到数轮攻击，网站标题被黑客改为“三聚氰胺集团”；首页也被改为“看三聚氰胺集团新闻有感”，甚至一度成为了黑客们的聊天和“集体路过”场所。在第二轮攻击中，“三聚氰胺”被作为产品名称列在三鹿的产品网页上。2008年9月13日，中国国务院启动国家安全事故I级响应机制（“I级”为最高级：指特别重大食品安全事故）处置三鹿奶粉污染事件。患病婴幼儿实行免费救治，所需费用由财政承担。有关部门对三鹿婴幼儿奶粉生产和奶牛养殖、原料奶收购、乳品加工等各环节开展检查。质检总局将负责会同有关部门对市场上所有婴幼儿奶粉进行了全面检验检查。石家庄官方初步认定，三鹿“问题奶粉”为不法分子在原奶收购中添加三聚氰胺所致，已经拘留了19名嫌疑人，传唤了78人。这19个人中有18人是牧场、奶牛养殖小区、奶厅的经营人员，其余1人涉嫌非法出售添加剂。河北省政府决定对三鹿集团立即停产整顿，并将对有关责任人做出处理。三鹿集团董事长和总经理田文华被免职，后并遭刑事拘留，而石家庄市分管农业生产的副市长张发旺等政府官员、石家庄市委副书记、市长冀纯堂也相继被撤职处理。河北省委也决定免去吴显国河北省省委常委、石