基因工程的操作

第二节基因工程的基本操作程序生长快、肉质好的转基因鱼(中国)

基因工程（DNA重组技术）是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定概念：一、目的基因的获取目的基因：

主要是指编码蛋白质的基因，例如，与优良品质相关的基因，与生物药物和保健品相关的基因，以及与工业所需酶相关的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。获取目的基因的方法：人工合成从基因文库中获得目的基因PCR技术扩增从基因文库中获得目的基因1、概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因库。2、分类:基因组文库部分基因文库(如cDNA文库)基因组文库:将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段，也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。cDNA文库如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库。基因组文库的构建②cDNA文库的构建-----反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)思考？1、怎样从基基因文库中得得到我们所需需的目的基因因?根据基因的核苷酸序列，，基因的功能能，基因在染染色体上的位位置，基因的的转录产物mRNA，以以及基因的表表达产物蛋白白质等特殊性性来获得目的基基因。利用PCR技技术扩增目的基因1、定义：PCR是多聚酶链式反反应的缩写，是一一项在生物体外复制特定DNA片段的核核酸合成技术术，通过这一一技术，可以以在短时间内内大量扩增目目的基因。2、原理：它是利用DNA双链复制制的原理，将将基因的核苷苷酸序列不断断地加以复制制，使其数量量呈指数方式增长长(约2n，其中n为扩扩增循环的次次数）。3、基本前提提：要有一段已知知目的基因的的核苷酸序列列，以便根据据这一序列合合成引物。4、过程：（1）加热至至90℃~95℃，使双链DNA模板两条条链之间的氢键打开开，变成单链链DNA，作作为互补链聚聚合反应的模板板。(DNA变性性）（2）将温度度降至55℃~60℃，使两种引物分别与模板DNA的的一端互补序序列互补配对。（退火）（3）将温度度升至70℃~75℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，使DNA链延伸伸。（延伸）是一小段单链链DNA，作为DNA复制的起始始点，在核酸酸合成反应时时，作为每个个多核苷酸链链进行延伸的的出发点而起起作用的多核苷酸链.引物：利用PCR技技术扩增目的的基因PCR扩增仪仪人工合成目的基因基因较小，核核苷酸序列已已知，可以利利用DNA合合成仪人工合合成.二、基因表达载体的构建基因表达载体的模式图抗生素抗性基因思考？将生物的所有有DNA直接接导入受体细细胞不是更简简便吗？表达载体的构构建使目的基基因在受体细细胞中稳定存在，并并且以遗传给给下一代，同时是目的的基因能够表表达和发挥作作用。基因表达载体组分分目的基因启动子：是一段有特殊殊结构的DNA片段，位位于基因的首首段，它是RNA聚合酶酶识别的结合部位，有了它才能能驱动基因转转录mRNA。终止子：也是一段有特特殊结构的DNA片段，，位于基因的的末端，使转录在这里终终止。标记基因：是为了鉴定受受体细胞中是是否含有目的的基因，从而而将含有目的的基因的细胞胞筛选出来。。①载体与表达载体的区别：二者者都有标记基基因和复制原点两两部分DNA片段。表达达载体在载体基础上增加加了目的基因因、启动子、、终止子三部分结构.②用到的工具酶酶：既用到限制酶酶切割载体，，又用到DNA连连接酶将目的的基因和载体体拼接，两种酶作用的化化学键都是磷磷酸二酯键.③启动子、终止止子对于目的基因因表达必不可可少.④目的基因不能能单独进入受受体细胞，必需以表达载体的方式式携带进去。。注意三、将目的基因导入受体A、将目的基因因导入入植物细胞农杆菌转换法法（最常用）基因枪法花粉管通道法法1、农杆菌转转换法农杆菌：是一种在土壤壤中生活的微微生物，，能能在自然界感感染双子叶植物和和裸子植物，而对大多数数单子叶植物没有感染能力力。原理：当植物受到损损伤时，伤口口处的细胞会会分泌大量的的酚类化合物，吸引龙杆菌菌移向这些细细胞，这时龙龙杆菌的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA)可转转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色色体的DNA上。转化过程2、基因枪法法原理：利用压缩气体产生的动力，，将包裹在金金属颗粒表面面的表达载体体DNA打入入受体细胞中中，使目的基基因与其整合合并表达的方方法。应用：单子叶植物，但成本较高高3、花粉管通通道法B、将目的基因因导入动物细胞1、方法：显微注射法2、步骤：（1）首先将将含有目的基基因的表达载载体提纯。（2）从雌性性体内取出受受精卵，采用用显微注射仪进行显微注射射。（3）再将注射射了目的基因因的受精卵，，经胚胎早期培养一一段时间后，再移植到雌雌性动物的输卵卵管或子宫内内，使其发育育称为具有新现状的动物。C、将目的基因因导入微生物细胞1、受体：由于原核生物具有繁殖快，，多为单细胞胞，遗传物质质相对较少等等特点，因此此。早期的基基因工程操作作都用原核生物作为受体细胞胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛泛。2、导入方法法：（1）首先用Ca2+处理细胞，使使细胞处于一一种能吸收周围环境中中DNA分子的生理状状态，这种细细胞称为感受态细胞。（2）将重组组表达载体DNA分子溶溶于缓冲液与与感受态细胞融合，，在一定温度下促进感受态细细胞吸收DNA分子，，完成转化过过程。四、目的基因因的检测与鉴定定1、受体细胞胞的DNA是是否插入了目的基基因。2、目的基基因是否转录出了mRNA。。3、检测目目的基因是是否翻译成蛋白白质。受体细胞的的DNA是是否插入了目的的基因1、方法：：DNA分子子杂交技术术2、步骤：：（1）将转转基因生物物的基因组DNA提取出来。。（2）制备备一个含有有目的基因因的DNA片段段，在片段上用同位素标记记，作为探针。。（3）使探探针与基因因组DNA杂交，如果显示示出杂交带，说明目的的基因已经经插入染色色体DNA中。目的基因是是否转录出了mRNA1、方法：：分子杂交技技术2、步骤：：（1）将转转基因生物物的mRNA提取出来。。（2）制备备一个含有有目的基因因的DNA片段段，在片段上用同位素标记记，作为探针。（3）使探针与mDNA杂交，如果显示出出杂交带，说明目的基因因转录出了mRNA。检测目的基因因是否翻译成蛋蛋白质1、方法：抗原——抗体体分子杂交2、步骤：（1）将转基基因生物的蛋白质提取出来。（2）制备一一个相应的抗体，抗体用同位位素标记。（3）使使抗体与蛋白质杂交，如如果显示示出杂交带，说明目目的基因因已经形成成蛋白质质。1、在已已知某小小片段基基因碱基基序列的的情况下下，获得得该基因因的最佳佳方法是是A．用mRNA为模模板逆转转录合成成DNAB．以4种脱脱氧核苷苷酸为原原料人工工合成C．将供体DNA片片段转入入受体细细胞中，，再进一一步筛选选D．由蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸序序列列推推测测mRNA答案案：：B2、、下下列列高高科科技技成成果果中中，，根根据据基基因因重重组组原原理理进进行行的的是是（（））①我我国国科科学学家家袁袁隆隆平平利利用用杂杂交交技技术术培培育育出出超超级级水水稻稻②我国科学家家将苏云金杆杆菌的某些基基因移植到棉棉花内，培培育育出抗虫棉③我国科学家家通过返回式式卫星搭载种种子培育出太太空椒④我国科学家家通过体细胞胞克隆技术培培养出太空牛牛A．①B．①①②C．①②②③D．②③③④答案：B3、镰刀型细细胞贫血症的的病因是血红红蛋白基因的的碱基序列发发生了改变。。检测这种碱碱基序列改变变必须使用的的酶是（（））A．解旋酶B．DNA连连接酶C．限制性内内切酶D．RNA聚合酶解析：检测这这种碱基序列列改变需将被被测基因从DNA上切下下来进行扩增增，该过程需需要限制性内内切酶。在扩扩增后，通过过热变性即可可使待测基因因解旋成单链链，与已知碱碱基序列的贫贫血病基因制制成的DNA探针进行分分子杂交，根根据形成双链链的情况即可可测知其碱基基序列，此过过程无需解旋旋酶，更不需需要形成重组组DNA分子子所需的DNA连接酶和和基因转录所所需的RNA聚合酶。据据以上分析可可知，必须使使用的酶是C、限制性内内切酶。答案：C4、下列关于于基因工程的的叙述，正确确的是（））A．基因工程程经常以抗菌菌素抗性基因因为目的基因因B．细菌质粒粒是基因工程程常用的运载载体C．为培育成成抗除草剂的的作物新品种种，导入抗除除草剂基因时时只能以受精精卵为受体D．通常用一一种限制性内内切酶处理含含目的基因的的DNA,用另一种种处理运载体体DNA解析：基基因工程程经常以以抗菌素素抗性基基因为标标记基因因；质粒粒是基因因工程常常用的运运载体；；通常用用同一种种限制酶酶切割目目的基因因和运载载体，以以获得相相同的黏黏性末端端；受体体细胞可可以是受受精卵，，也可以以是体细细胞。答案：B5、利用用外源基基因在受受体细胞胞中表达达，可生生产人类类所需要要的产品品。下列列各项中中能说明明目的基基因完成成了在受受体细胞胞中表达达的是A．棉花花二倍体体细胞中中检测到到细菌的的抗虫基基因B．大肠肠杆菌中中检测到到人胰岛岛素基因因及其mRNAC．山羊羊乳腺细细胞中检检测到人人生长激激素DNA序列列D．酵母母菌细胞胞中提取取到人干干扰素蛋蛋白答案：D9、静夜四四无邻，，荒居旧旧业贫。。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黄黄叶树，，灯下白白头人。。。06:00:1706:00:1706:0012/23/20226:00:17AM11、以我我独沈沈久，，愧君君相见见频。。。12月月-2206:00:1706:00Dec-2223-Dec-2212、故人人江海海别，，几度度隔山山川。。。06:00:1706:00:1706:00Friday,December23,202213、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。12月月-2212月月-2206:00:1706:00:17December23,202214、他乡生白白发，旧国国见青山。。。23十二二月20226:00:17上上午06:00:1712月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月226:00上上午午12月月-2206:00December23,202216、行动出出成果，，工作出出财富。。。2022/12/236:00:1706:00:1723December202217、做前，能够够环视四周；；做时，你只只能或者最好好沿着以脚为为起点的射线线向前。。6:00:17上午6:00上上午06:00:1712月-229、没有失败，，只有暂时停停止成功！。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、很多事情努努力了未必有有结果，但是是不努力却什什么改变也没没有。。06:00:1706:00:1706:0012/23/20226:00:17AM11、成功就是是日复一日日那一点点点小小努力力的积累。。。12月-2206:00:1706:00Dec-2223-Dec-2212、世间成事，，不求其绝对对圆满，留一一份不足，可可得无限完美美。。06:00:1706:00:1706:00Friday,December23,202213、不知香积积寺，数里里入云峰。。。12月-2212月-2206:00:1806:00:18December23,202214、意志坚强强的人能把把世界放在在手中像泥泥块一样任任意揉捏。。23十二二月20226:00:18上上午06:00:1812月-2215、楚塞三三湘接，，荆门九九派通。。。。十二月226:00上午午12月-2206:00December23,202216、少年年十五五二十十时，，步行行夺得得胡马马骑。。。2022/12/236:00:1806:00:1823December202217、空山山新雨雨后，，天气气晚来来秋。。。6:00:18上上午6:00上上午午06:00:1812月月-229、杨柳柳散和和风，，青山山澹吾吾虑。。。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、阅读一切切好书如同同和过去最最杰出的人人谈话。06:00:1806:00:1806:0012/23/2022