TCMBA 020-2023 人正常乳腺及乳腺癌类器官制备、冻存、复苏和鉴定操作指南

ICS11CCSC05T/CMBA团 体 标 准T/CMBA020—2023Guidelineforpreparation,cryopreservation,recoveryandidentificationoforganoidsofhumannormalbreastandbreastcancertissue2023-2-21发布 2023-2-21实施中国医生物协会 发布T/CMBA020T/CMBA020—2023目 次前言 I引言 II1范围 12规性用13术和14通则 24.1案订 24.2知同意 25类官2织本2织本保和2器制、养传代 26类官存复苏 37类官38数管理 39废物310量3附录A（资性）人常乳及腺类官备、存复操要点 4A.1仪设及剂42人常腺乳类器制操步骤 5A.3正乳及腺类器冻和苏心6附录B（资性）人常乳类官乳癌器官鉴定 7B.1概述 7B.2器显镜的态学73类官胞性7B.4类官织特7B.5器分分鉴定 8参考文献 10T/CMBA020T/CMBA020—2023T/CMBA020T/CMBA020—2023IIIIII前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。引 言T/CMBA020T/CMBA020—2023T/CMBA020T/CMBA020—2023PAGEPAGE1PAGEPAGE10人正常乳腺及乳腺癌类器官制备、冻存、复苏和鉴定操作指南范围本文件适用于科研院所、医疗机构、制药企业等构建人源正常乳腺及乳腺癌组织类器官。（）GB19489—2008实验室生物安全通用要求GB39707—2020医疗废物处理处置污染控制标准下列术语和定义适用于本文件。3.1人正常乳腺类器官humannormalbreastorganoids人体正常乳腺上皮组织中的上皮干细胞或者多能干细胞经体外诱导分化，在有支架材料的培养3.2人乳腺癌类器官humanbreastcancer-derivedorganoids3.3支架材料scaffoldmaterial用于辅助或支撑类器官体外培养的生物材料，包括天然材料如基质凝胶和合成材料。3.4传代passage将类器官制备为单细胞或细胞簇后再进行培养形成新的类器官的过程。3.5冻存cryopreservation将类器官经低温冷冻处理后在低温环境下长期保存并保持类器官细胞活力的技术。3.6复苏recovery将冻存的类器官解冻后进行培养,恢复类器官细胞组织活性的过程。通则注：除所用的培养基外，正常乳腺类器官和乳腺癌类器官的培养流程相同。（0～类器官制备、培养步骤如下：4缓冲液，清洗时上下左右迅速摇晃，摇晃力度适中，直至清洗液澄清；选择组织消化液和/（（详细操作规程和推荐的方法参见附录A详细操作规程和推荐的方法参见附录A。A详细操作规程和推荐的方法参见附录B。(GCP)GB19489—20087.19GB/T38736—20203.1Ki67B附 录 A（）人正常乳腺及乳腺癌类器官制备、冻存和复苏操作要点生物安全柜、低温离心机、二氧化碳细胞培养孵箱、光学显微镜、37℃水浴锅、低温冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、液氮罐等。耗材细胞培养孔板或芯片、15mL50mL试剂组织保存液、DPBS、胶原酶、支架材料、类器官培养基、细胞级别二甲基亚砜等。推荐的正常乳腺类器官培养基的组成成分见表A.1。表A.1正常乳腺类器官培养基组成成分表中文名称英文名称基础培养基AdvanceDMEM/F12WNT信号通路激活剂R-Spondin1WNT3aWnt3a神经调节蛋白1Neuregulin1L-谷氨酰胺L-GlutamaxROCK抑制剂ROCKinhibitorY-27632人头蛋白Nogginsirtuins抑制剂NicotinamideTGFβ抑制剂A83-01TGFβinhibitorA83-01纤维母细胞生长因子10FGF10人表皮细胞因子EGFB27添加剂B27supplement乙酰半胱氨酸N-acetylcysteinePrimocin抗生素Primocin氢化可的松Hydrocortisoneβ-雌二醇β-estradiol腺苷酸环化酶激活剂Forskolin推荐的乳腺癌类器官培养基的组成成分见表A.2。表A.2乳腺癌类器官培养基组成成分表中文名称英文名称基础培养基AdvanceDMEM/F12WNT信号通路激活剂R-Spondin3青霉素/链霉素Penicillin/streptomycin神经调节蛋白1Neuregulin1L-谷氨酰胺L-GlutamaxROCK抑制剂ROCKinhibitorY-27632人头蛋白Noggin4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸HEPESsirtuins抑制剂NicotinamideTGFβ抑制剂A83-01TGFβinhibitorA83-01纤维母细胞生长因子10FGF10人表皮细胞因子EGFp38MAPK抑制剂SB202190B27添加剂B27supplement乙酰半胱氨酸N-acetylcysteinePrimocinTM抗生素Primocin重组人角质细胞生长因子FGF7在准备乳腺癌类器官培养时，阻止正常细胞生长的方法包括去除正常细胞必需的某些生长因子（（TP53通则50mL4DPBS/或10cm（≥103710min～15min14200×g5min0m100m20×g5in，取适量支架材料（）372～31120µm～180µm10类器官冻存步骤如下：10500μL～1mL8024类器官复苏步骤如下：10mL15mL3715mL1%。4℃下，200×g5min37附录B（资料性）人正常乳腺类器官和乳腺癌类器官的鉴定250μm性。）×100%>90（CFSE）染色法CFSEAdvancedDMEM/F12（1CFSE2.5μmol/L～10min40%10min100μL488nm一般情况下，计算及统计出的类器官活细胞比率>90%时则表示培养的类器官活力优秀，质量良好。1～2100μm石蜡包埋及切片处理步骤如下：（470%80%95%1005min～10min）5minc)5μm（H&E）染色苏木素&伊红（H&E）染色步骤如下：3，10095%33min3min40μL）10s；10s；95%3，100%33免疫组化检测步骤如下：将类器官切片（B.4.2）33min0.3Triton100PBS20min；PBS35min；（40μL）30min～60min；（（40μL）4℃PBS35min；（40μL）20min；PBS35min；40μL）1DAB403min10s5min～10min；1min95%100%3min，以上步骤3ABHER2ERPRHER2Ki67ER、PRHER2Ki67KRT8/18、CD24)和基底/ATAC2CNN1GABRPKITALDH1A3AGR2、ANKRD30AESR1、FOXA1PGRITGA6、KRT5/6B、KRT14TP63定，包括但不限于RNA-seq或者荧光定量PCR实用于检测目标基因的转水平变化，免疫印迹验用检目蛋表水平化 参考文献..2019-05-28.中国胞物学.T/CSCB0001-2020 细用要.京:国标版社,2020.,,.(2020版).,2020,42(10):781-797.,.(2022).,2022,32(7):657-668.,..,2018,25(5):380-383.,..2020-04-23..2020.:2020.中华民和国卫和计生委会政管局.全临检操规程. 第4版北京:民生版社,2015.SachsN,deLigtJ,KopperO,etal.Alivingbiobankofbreastcancerorganoidscapturesdiseaseheterogeneity.Cell,2018,172(1-2):373-386.e10.DekkersJF,vanVlietEJ,SachsN,etal.Long-termculture,geneticmanipulationandxenotransplantationofhumannormalandbreastcancerorganoids.NatProtoc,2021,16(4):1936-1965.RosenbluthJM,SchackmannRCJ,GrayGK,etal.Organoidculturesfromnormalandcancer-pronehumanbreasttissuespreservecomplexepitheliallineages.NatCommun,2020,11(1):1711.TuvesonD,CleversH.Cancermodelingmeetshumanorganoidtechnology.Science,2019,364(6444):952-955.GuillenKP,FujitaM,ButterfieldAJ,etal.Ahumanbreastcancer-derivedxenograftandorganoidplatformfordrugdiscoveryandprecisiononcology.NatCancer,2022,3(2):232-250.MollicaPA,Booth-CreechEN,ReidJA,etal.3DbioprintedmammaryorganoidsandtumoroidsinhumanmammaryderivedECMhydrogels.ActaBiomater,2019,95:201-213.CampanerE,ZanniniA,SantorsolaM,etal.Breastcancerorganoidsmodelpatient-specificresponsetodrugtreatment.Cancers(Basel),2020,12(12):3869.DekkersJF,WhittleJR,Vaillantetal.ModelingbreastcancerusingCRISPR-Cas9-mediatedengineeringofhumanbreastorganoids.JNatlCancerInst,2020,112(5):540-544.GoldhammerN,KimJ,Timmermans-WielengaV,etal.Characterizationoforganoidculturedhumanbreastcancer.BreastCancerRes,2019,21(1):141.BhatiaS,KramerM,RussoS,etal.Patient-derivedtriple-negativebreastcancerorganoidsproviderobustmodelsystemsthatrecapitulatetumorintrinsiccharacteristics.CancerRes,2022,82(7):1174-1192.YangLiuB,ChenH,etal.Progressintheapplicationoforganoidstobreastcancerresearch.JCellMolMed,2020,24(10):5420-5427.JinX,GeLP,DQ,etal.LncRNATROJANpromotesproliferationandresistancetoCDK4/6inhibitorviaCDK2transcriptionalactivationinER+breastcancer.MolCancer,2020,19(1):87.YuJ,HuangW.Theprogressandclinicalapplicationofbreastcancerorganoids.IntJStemCells,2020,13(3):295-304.GoldhammerN,Kim