基因工程选修三DNA重组技术的基本工具

1.什么叫基因？思考讨论3.遗传信息是如何表达的？

2.基因、DNA、染色体之间是怎样的关系？苏云金芽孢杆菌毒蛋白

按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。一、基因工程的概念别名操作环境操作对象操作水平原理结果DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平定向地改造生物的遗传性状基因重组一、基因工程的概念基因工程操作依据的理论基础细胞生物都以DNA作为遗传物质，且其基本结构是相同的；各种生物表达基因共用一套密码子。棉花细胞(不能抗虫)抗虫基因转基因抗虫棉(能抗虫)苏云金芽孢杆菌目的基因提取导入剪刀针线运载体检测表达受体细胞分子手术刀分子缝合针分子运输车培育转基因抗虫棉的简要过程项目内容来源种类及命名作用特点作用结果主要来源于原核生物属名头字母+种名头2字母现已从300微生物中分离出约4000种限制酶1.分子手术刀——限制酶

识别别双双链链DNA分分子子中中特定定核核苷苷酸酸序序列列切割割特特定定序序列列中中的的特定定位位点点专一性限制制酶酶作作用用的的化化学学键键项目内容来源种类及命名作用特点作用结果主要要来来源源于于原原核核生生物物属名名头头字字母母+种名名头头2字母母现已已从从300微生生物物中中分分离离出出约约4000种限限制制酶酶1.分子子手手术术刀刀———限制制酶酶能够够识识别别双双链链DNA分子子某种种特特定定核核苷苷酸酸序序列列，并并且且使使每每一一条条链链中中特定定部部位位的两两个个核核苷苷酸酸之之间间的的磷酸酸二二酯酯键键断开开。。黏性性末末端端或或平平末末端端DNA1CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTDNA2GGCATCTTAAAATTCCGTAG

重组组DNAGGCATCTTAAAATTCCGTAG由于于切切割割后后的的载载体体和和目目的的基基因因具具有有相相同同的的末末端端，，故故重重组组DNA存在3中可能能连接接。即、、。重组DNA一定是是载体体-目的基基因连连接吗吗？载体-目的基基因载体-载体目的基基因-目的基基因DNA连接酶酶连接接重组组DNA分子项目内容种类作用部位结果E.coliDNA连接酶酶T4DNA连接酶酶只作用用于末端主要作作用于于末端，，还可作作用于于末端磷酸二二酯键键黏性平黏性通过形形成新新的磷磷酸二二酯键键，形成重重组DNA2.分子缝缝合针针——DNA连接酶酶复习基因工工程的的原理理？基因工工程的的基本本工具具？限制酶酶的作作用特特点及及作用用结果果？DNA连接酶酶的种种类及及作用用特点点？DNA连接酶酶和DNA聚合合酶酶的的比比较较？？DNA连接酶DNA聚合酶作用实质作用过程催化化两两个个脱脱氧氧核核苷苷酸酸之之间间形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键在两两个个DNA片段段之之间间形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键将单单个个核核苷苷酸酸加加到到DNA片段段上上，，形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键项目内容作用具备条件种类质粒③能够够在在宿宿主主细细胞胞中中复制制并并稳稳定定地地保保存存；目的的基基因因怎怎样样才才能能遗遗传传到到子子细细胞胞呢呢？？将外外源源基基因因导导入入受受体体细细胞胞④具有有特特殊殊的的标记记基基因因，便便于于进进行行筛选选；质粒粒、λ噬菌菌体体的的衍衍生生物物和和动动植植物物病病毒毒一种种祼祼露露的的、、结结构构简简单单、、独独立立于于细细菌菌拟拟核核DNA之外外，，能能够够自自我我复复制制的的很很小小的的双双链链环环状状DNA分子子。。①对受受体体细细胞胞无害害②具有有一一个个或或多多个个限制制酶酶切切点点，以以便便与与外外源源基基因因插插入入；；载体体能能对对受受体体细细胞胞有有害害吗吗？？载体体怎怎样样才才能能具具有有能能连连接接不不同同目目的的基基因因的的潜潜能能呢呢？？目的的基基因因是是否否进进入入受受体体细细胞胞，，你你如如何何察察觉觉？？3.分子子运运输输车车———载体体已知知标标记记基基因因有有抗抗四四环环素素基基因因和和抗抗氨氨苄苄青青霉霉素素的的基基因因，，现探讨某细菌菌的质粒中有有无标记基因因或标记基因因是什么？请设计实验验、预期实验验结果，并得得出相应的实实验结论。不添加抗生素添加一定浓度的四环素添加一定浓度的氨苄青霉素添加一定浓度的两种抗生素ABCD练习A组B组C组D组结论预期一＋＋＋＋预期二＋＋－－预期三＋－＋－预期四＋－－－既含有抗四环素素基因也含有抗氨苄青青霉素基因只含有抗四环环素基因只含有抗氨苄苄青霉素基因因既不含有抗四环素基因因也也不含有抗氨苄青霉素素基因不添加抗生素添加一定浓度的四环素添加一定浓度的氨苄青霉素添加一定浓度的两种抗生素ABCD三大工具分子手术刀——限制性内内切酶分子缝合针——DNA连连接酶分子运输车——运载体小节：基因工工程的工具非编码区编码区非编码区原核细胞基因因结构示意图图启动子终止子mRNA非编码区编码区非编码区真核细胞基因因结构示意图图启动子外显子内含子终止子成熟mRNA目的基因的获获取基因表达载体体的构建目的基因导入入受体细胞目的基因的检检测与鉴定有了目的基因因，我们才能能赋予一种生生物以另一种种生物的遗传传特性。使目的的基因因在受受体细细胞中中稳定定存在在，并并可进进行遗遗传、、表达达和发发挥作作用载体进进入受受体细细胞稳稳定表表达，，才能能实现现一种种生物物的基基因在在另一一种生生物中中的转转化。。才能确确定目目的基基因是是否真真正在在受体体细胞胞中稳稳定遗遗传和和正确确表达达。基因工工程基基本操操作的的四个个步骤骤1234（一））目的的基因因主要要是______________________。编码蛋蛋白质质的结结构基基因（三））获取取目的的基因因的常常用方方法有有哪些些?1、从基基因文文库中中获取取2、利用用PCR技术扩扩增3、化学学方法法人工工合成成一、目目的基基因的的获取取（二））目的的基因因的来来源：：1、从自自然界界中已已有物物种中中分离离出来来2、人工工的方方法合合成1.基因文文库：：2.基因文文库的的分类类：种类基因组组文库库：含有一一种生生物的的全部基因部分基基因文文库：：只包含含了一一种生生物的的部分基因，，如：cDNA文库（一））从基基因文文库中中直接接获取取提取某某种生生物的的全部部DNA限制酶酶切一定大大小的的DNA片段与载体体连接接导入受受体菌菌中储储存基因组组文库库3.基因文文库的的构建建方法法（1）基因因组文文库某种生生物的的单链链mRNA单链互互补DNA双链DNA片段导入受受体菌菌中储储存与载体体连接接cDNA文库逆转录录酶DNA聚合酶酶（2）部分分基因因文库库文库类型cDNA文库基因组文库文库大小启动子内含子基因多少物种间基因交流1.概念：PCR全称为_________________，是一项在生物______复制_______________的核酸合成技术。多聚酶链式反应体外特定DNA片段2.原理：：体外模模拟双双链DNA复制（二））利用用PCR技术扩扩增目目的基基因四种脱脱氧核核苷酸酸(dNTP)一对引引物：：热稳定定DNA聚合酶酶(Taq酶）模板DNA(含有目的基基因)3.条件：与目的基因因的起始段段互补核苷苷酸序列一段已知目目的基因的的核苷酸序序列4.前提：变性（90℃-95℃）：目的基基因DNA受热变性性后解链为为单链；复性（55℃-65℃）：引物与与单链相应应互补序列列结合；延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下下，合成与与模板互补补的DNA链；约2n5.过程PCR技术扩增与与DNA复制的比较较PCR技术DNA复制相同点原料条件不同点解旋方式场所酶结果四种脱氧核核苷酸模板、、能量量、酶酶高温下下变性性解旋旋解旋酶酶催化化体外复复制主要细细胞核核内热稳定定的DNA聚合酶酶细胞内内的DNA聚合酶酶大量的的DNA片段形成整整个DNA分子蛋白质质的氨氨基酸酸序列列mRNA的核苷苷酸序序列结构基基因的的核苷苷酸序序列目的基基因推测测推测测化学学合合成成例：：根根据据已已知知的的氨氨基基酸酸序序列列合合成成DNA法：：（三三））化化学学方方法法人人工工合合成成的的目目的的基基因因适用用：：基基因因比比较较小小，，核核苷苷酸酸序序列列已已知知1.目的的：：使目目的的基基因因在受受体体细细胞胞中中稳稳定定存存在在，并并且且可可以以遗遗传传给给下下一一代代，，同同时时使使目目的的基基因因能够够表表达达和和发发挥挥作作用用。二、、基基因因表表达达载载体体的的构构建建2.基因因表表达达载载体体的的组组成成：：启动动子子+目的的基基因因+终止止子子+标记记基基因因（一一））转转化化：：（二二））方方法法目的的基基因因进进入入_________内，，并并且且在在受受体体细细胞胞内内维维持持_____和_____的过过程程。。受体体细细胞胞稳定定表达达三、、将将目目的的基基因因导导入入受受体体细细胞胞1、将目的的基因导导入植物物细胞的的方法：：（1）农杆菌转转化法①农杆菌菌特点：：易感染双子叶植植物和裸裸子植物物，对大多多数单子子叶植物物没有感感染能力力。②原理：植植物体受受损伤时时，伤口口细胞会会分泌酚类化合合物，吸引农农杆菌，，农杆菌菌的Ti质粒上的的T-DNA可以转移移到受体体细胞，，并整合合到受体体细胞染染色体的的DNA上。③过程：④优点：经济有效效（2）基因枪法法（3）花粉管通通道法缺点：成成本较高高受体细胞胞(单子叶植植物)我国科学学家独创创，转基基因抗虫虫棉2、将目的的基因导导入动物物细胞①方法：显微注射射法②程序：③常用的的动物受受体细胞胞：受精卵和和卵细胞胞3、将目的的基因导导入微生生物细胞胞①原核生物物特点：：繁殖快快、单细细胞、遗遗传物质质少②方法：用Ca2+处理细胞胞→感受态态细胞(吸收环境境中DNA生理状态态)→表达载载体(缓冲液)与感受态态细胞混混合→(温度)感受态细细胞吸收收DNA分子（二）方方法将目的基基因导入入植物细胞胞将目的基基因导入入动物细胞胞将目的基基因导入入微生物细细胞农杆菌转转化法基因枪法法花粉管通通道法——显微注射射法——感受态细细胞法三、将目目的基因因导入受受体细胞胞四、目的的基因的的检测与与鉴定（一）检检测（分分子水平平）1、检测转转基因生生物的DNA上是否插插入了目目的基因因①提取转基基因生物物的基因因组DNA②用含目的的基因的的DNA片段用放射性同同位素等作标记记，以此此做探针③使探针和和转基因因生物的的基因组组杂交,若显示出出杂交带，表明染染色体已已插入染染色体DNA中（1）方法:DNA分子杂交交（2）过程:2、检测目目的基因因是否转转录出了了mRNA3、检测目目的基因因是否翻翻译成蛋蛋白质（1）方法:分子杂交交方法:抗原-抗体杂交交（2）过程:用上述述探针针和转转基因因生物物的mRNA杂交，，若出出现杂交带带,表明目目的基基因转转录出出了mRNA（二））鉴定定（个个体生生物学学水平平）抗虫、、抗病病接种种实验验，活活性比比较等等人体细细胞质粒大肠杆杆菌目的基基因(人胰胰岛素素基因因)用同一一种限限制酶酶进行酶酶切DNA连接接酶连连接目目的基基因和和质粒粒重组质质粒(重组组DNA)重组质质粒导导入大大肠杆杆菌细细胞繁殖人胰岛岛素复制目目的基基因获取目目的基基因从基因因文库库中获获取目目的基基因利用PCR技术扩扩增目目的基基因化学方方法人人工合合成目目的基基因构建基基因表表达载载体目的基基因、、启动动子、、终止止子、、标记记基因因将目的的基因因导入入受体体细胞胞植物、、动物物、微微生物物目的基基因的的检测测与鉴鉴定检测：：分子子水平平是否否插入入、转转录、、翻译译鉴定：：个体体水平平小节:基因工工程的的基本本操作作程序序基因工工程的的基本本工具具？限制酶酶的特特点？？DNA连接酶酶和载载体的的种类类？基因工工程的的基本本操作作程序序？获取目目的基基因的的方法法？基因工工程的的核心心步骤骤是？？基因表表达载载体的的组成成？将抗虫虫基因因转移移到棉棉花细细胞中中遗传传和表表达称称为？？将目的的基因因导入入植物物、动动物、、微生生物细细胞的的方法法？T-DNA的特点点？目的基基因能能否在在受体体细胞胞中稳稳定遗遗传的的关键键？目的基基因的的检测测与鉴鉴定的的方法法？复习一、植植物基基因工工程硕硕果累累累转基因因工程程技术术主要要用于于提高农农作物物的抗抗逆能能力,以及改良农农作物物的品品质和利用植植物生生产药药物等方面面。(一)抗虫转基因因植物杀虫基因：：Bt毒蛋白基因因蛋白酶抑制制剂基因淀粉酶抑制制剂基因植物凝集素素基因Bt毒蛋白基因因蛋白酶抑制制剂基因淀粉酶抑抑制剂基基因植物凝集集素基因因产生的抑抑制剂可可与害虫虫消化道道的蛋白白酶结合合淀粉酶抑抑制剂抑抑制昆虫虫消化道道中的淀淀粉酶活活性合成的糖糖蛋白可可与昆虫虫肠道粘粘膜上的的某种物物质结合合编码的蛋蛋白质在在害虫肠肠道降解解成有毒毒的多肽肽转基因抗抗虫棉(二)抗病转基基因植物物病原微生生物：主要有病病毒、真真菌和细细菌等。。抗病转基因植植物采用用的基因因：抗真菌转基因植植物采用用的基因因：病毒外壳壳蛋白基基因（CP基因）病毒复制制酶基因因几丁质酶酶基因抗毒素合合成基因因(三)抗逆转基基因植物物可以调节节细胞渗渗透压的的基因抗冻蛋白白基因抗除草剂剂基因(四)利用转基基因改良良植物的的品质将必需氨氨基酸含含量多的的蛋白质质编码基基因导入入植物；；改变这这些氨基基酸合成成途径中中某种关关键酶的的活性。。例如如：：将将富富含含赖赖氨氨酸酸的的蛋蛋白白质质编编码码基基因因导导入入玉玉米米，，赖赖氨氨酸酸含含量量提提高高30%。将控控制制番番茄茄果果实实成成熟熟的的基基因因导导入入番番茄茄，，获获得得转转基基因因延延熟熟番番茄茄；；将植植物物花花青青素素代代谢谢有有关关的的基基因因导导入入花花卉卉植植物物矮矮牵牵牛牛中中，，出出现现颜颜色色变变异异。。二、、动动物物基基因因工工程程前前景景广广阔阔1.用于于提提高高动动物物生生长长速速度度2.用于于改改善善畜畜产产品品的的品品质质外源源生生长长素素基基因因将肠肠乳乳糖糖酶酶基基因因导导入入奶奶牛牛基基因因组组普通鼠和生长速度加快的转基因鼠（右）3.用转转基基因因的的动动物物生生产产药药物物乳腺生物物反应器器乳房生物物反应器器将药用蛋蛋白基因因与乳腺腺蛋白基基因的启启动子等等调控组组件重组组在一起起。获取目的的基因（例如血血清蛋白白基因））构建基因因表达载载体（在血清清白蛋白白基因前前加特异异表达的的启动子子）显微注射射导入哺哺乳动物物受精卵卵中形成胚胎胎将胚胎送送入母体体动物发育成转转基因动动物（只有在在产下的的雌性动动物个体体中，转转入的基基因才能能表达））4.用转基因因的动物物作器官官移植的的供体1、供体动动物：2、存在的的难题：：3、解决方方法：将供体基基因组导导入某种种基因调调节因子子，以抑抑制抗原原决定基基因的表表达；或设法除除去抗原原决定基基因，再再结合克克隆技术术，培育育出没有有免疫排排斥反应应的转基基因克隆隆猪器官官。猪免疫排斥斥三.基因工程程药品异异军突起起利用基因因工程方方法制造造“工程程菌”，，可高效效率地生生产出各各种高质质量、低低成本的的药品。。我国已生生产的产产品：白细胞介介素-2、干扰素素、乙肝肝疫苗等等。近20种，年产产值达30亿。工程菌：：用基因工工程的方方法，使使外源基基因得到到高效率率表达的的菌类细细胞株系系。作用：胰胰岛素是是治疗糖糖尿病的的特效药药。传统生产产方法：：主要要从猪、、牛等家家畜的胰胰腺中提提取，每每100kg胰腺只能能提取4~5g胰岛素。。产量低低，价格格昂贵。。基因工程程方法：：1979年，科学学家将动动物体内内的胰岛岛素基因因与大肠肠杆菌DNA分子重组，并并在大肠杆菌菌内实现了表表达。1982年，美国一家家基因公司用用基因工程方方法生产的胰胰岛素投入市市场，售价降降低了30%~50%。基因工程药品品——胰岛素基因工程药品品——干扰素化学本质：是是病毒侵入动动物或人体细细胞后产生的的一种糖蛋白白。作用：抗病毒毒的特效药。。干扰素产品基因工程药品品——生长激素治疗侏儒症的的唯一方法：：是向人体注注射生长激素素。传统生产方法法：需解剖尸尸体，从大脑脑的底部摘取取垂体，并从从中提取生长长激素。基因工程方法法，将人的生生长激素基因因导入大肠杆杆菌中，使其其生产生长激激素。人们从450L大肠杆菌培养养液中提取的的生长激素，，相当于6万具尸体的全全部产量。四、基因治疗疗曙光初照1）原理：把正常基因导入病人体内，使使该基因的表表达产物发挥挥功能，达到到治疗疾病的的目的。2）实例：复合型免疫缺缺陷症3）基因治疗的的方法①体外基因治疗疗：②体内基因治疗疗：先从病人体内内获得某种细细胞(T细胞)，进行培养，，体外进行基基因转移，筛筛选成功细胞胞扩增培养，，最后重新输输入患者体内内。直接向人体组组织细胞中转转移基因的治治疗方法。4）用于基因治治疗的基因种种类1.正常基因取代代病变基因；；弥补病变基基因；2.反义基因产生生mRNA与病变mRNA互补；3.编码可以杀死死癌细胞的蛋蛋白酶基因；；多聚半乳糖醛醛酸酶(PG)能降解果胶使使细胞壁破损损。成熟的番番茄果实中，，PG合成显著增加加，能使果实实变红变软，，但不利于保保鲜。利用基基因工程减少少PG基因的表达，，可延长果实实保质期。科科学家将PG基因反向接到到Ti质粒上，导入入番茄细胞中中，得到转基基因番茄，具具体操作流程程如图。据图图回答下列问问题：(原生质体是去去掉细胞壁的的植物细胞)(1)若已已获获取取PG的mRNA，可可通通过过________获取取PG基因因。。重重组组质质粒粒转转移移到到大大肠肠杆杆菌菌中中的的目目的的是是__________________________________________________________________。(2)用含含目目的的基基因因的的农农杆杆菌菌感感染染番番茄茄原原生生质质体体后后，，可可用用含含有有________的培培养养基基进进行行筛筛选选，，理理由由是是________________________。之之后后，，还还需需将将其其置置于于质质量量分分数数为为25%的蔗蔗糖糖溶溶液液中中，，观观察察细细胞胞________现象象来来鉴鉴别别细细胞胞壁壁是是否否再再生生。。(3)由于导入入的目的的基因能能转录出出反义RNA，且能与与________互补结合合，因此此可抑制制PG基因表达达的翻译译过程。。若______________，则可确确定转基基因番茄茄培育成成功。知识回顾顾基因工程程的实质质是什么么？将一种生物物的基因因转移到另一种生生物体内内，后者可以以产生它它本来不不能产生生的蛋白白质，进进而表现出出新的性性状。思考：基因工程程有没有有局限？？基因工程程产生的的蛋白质质有没有有不足？？1基因工程的局限性：a、基因工程在原则上只能生产自然界已存

在的蛋白质b、天然蛋白质不一定完全符合人类生产和

生活的需要2蛋白质工程的目的：生产符合人们生活需要的并非自然界已存在的蛋白质一、、蛋蛋白白质质工工程程崛崛起起的的缘缘由由例如如：：改造干扰素（半胱氨酸）体外很难保存干扰素（丝氨酸）体外可以保存半年玉米米中中赖赖氨氨酸酸含含量量比比较较低低天冬冬氨氨酸酸激激酶酶（352位的的苏苏氨氨酸酸））二氢氢吡吡啶啶二二羧羧酸酸合合成成酶酶（（104位的的天天冬冬酰酰胺胺））改造改造天冬冬氨氨酸酸激激酶酶（异异亮亮氨氨酸酸））二氢氢吡吡啶啶二二羧羧酸酸合合成成酶酶（（异异亮亮氨氨酸酸））玉米米中中赖赖氨氨酸酸含含量量可可提提高高数数倍倍1蛋白质工程的概念：以蛋白质分子的结构规律以及与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。2前提：了解蛋白质的结构和功能原理：改造基因（基因修饰或基因合成）目的：定向改造或制造蛋白质二、、蛋蛋白白质质工工程程的的基基本本原原理理与基基因因工工程程的的关关系系：：蛋白白质质工工程程是是在在基基因因工工程程的的基基础础上上，，延延伸伸出出来来的的第二二代代