第十单元 现代生物科技专题（1）基因工程的工具及程序（讲义）- 新高考生物一轮复习

第十单元现代生物科技专题（1）基因工程的工具及程序考点1基因工程的概念与原理一、基因工程的概念（1）基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。（2）对基因工程概念的深度理解别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达目的定向改造生物的遗传性状二、基因工程的原理基因工程的基本原理是让人们感兴趣的基因（目的基因）在宿主细胞中稳定和高效地表达。具体地说，基因工程就是在DNA分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。三、基因工程的诞生和发展（1）基础理论的突破：DNA是遗传物质的证明；DNA双螺旋结构和中心法则的确立；遗传密码的破译。（2）技术的发明：基因转移载体和工具酶的相继发现；DNA合成和测序技术的发明；DNA体外重组的实现及重组DNA表达实验的成功；第一例转基因动物的问世及PCR技术的发明。【例题练习】1.下列关于基因工程及其产品的说法中，不正确的有几项（

）

①基因工程中的目的基因是指编码蛋白质的基因

②基因工程的核心步骤是构建基因表达载体

③通过cDNA文库获得的目的基因有启动子，但没有内含子

④基因工程的优势是可定向地改造生物遗传性状

⑤基因工程中产生的可遗传变异属于染色体变异A.1项

B.2项

C.3项

D.4项答案：C解析：基因工程中的目的基因主要指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子，故①错误；基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，故②正确；③通过文库获得的目的基因没有启动子和内含子，故③错误；④基因工程可以按照人们的意愿，定向地改造生物的遗传性状，故④正确；基因工程的原理是基因重组，而不是染色体变异，故⑤错误。综上所述，错误的有3项，C符合题意。（多选题）2.下列关于基因工程的叙述中正确的是（）A.基因工程技术的成熟使人类可以定向改造生物的遗传特性，培育新的生物品种B.基因工程技术是唯一能克服远缘杂交不亲和障碍培育生物新品种的方法C.基因工程的实施需要限制酶、DNA连接酶和载体等基本工具D.目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物答案：ACD解析：基因工程技术的优点是人们可以根据自己的意愿，定向改造生物的某些性状，培育新的生物品种，并且可以克服远缘杂交不亲和的障碍，但不是唯一的技术，细胞工程技术也可以克服远缘杂交不亲和的障碍，A正确、B错误；基因工程的实施需要限制酶、DNA连接酶和载体等基本工具，C正确；基因工程中的目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物，D正确。。考点2DNA重组技术的基本工具一、限制性核酸内切酶（又称限制酶）——“分子手术刀”（1）来源：主要来自原核生物。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。（3）结果：产生黏性末端或平末端。（4）应用：已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同（填“相同”或“不同”），说明限制酶具有专一性。二、DNA连接酶——“分子缝合针”（1）作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（2）种类种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点缝合黏性末端缝合黏性末端和平末端作用缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1.种类①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的、环状的、裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。2.目的①将目的基因转运到宿主细胞中去。②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。（3）必备条件①在宿主细胞中保存下来并大量复制。②有多个限制酶切割位点。③有一定的标记基因，便于筛选。④对受体细胞无害。四、重组DNA分子的模拟操作（1）材料用具：剪刀代表EcoRⅠ，透明胶条代表DNA连接酶。（2）切割位点：①分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出—GAATTC—序列，并选G—A之间作切口进行“切割”。②再从另一条链上互补的碱基之间寻找EcoRⅠ相应的切口剪开。（3）操作结果：若操作正确，不同颜色的黏性末端应能互补配对；否则，说明操作有误。【技法提升】一、DNA连接酶与限制性核酸内切酶的比较1.区别作用应用限制性核酸内切酶使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于目的基因和载体的连接2.联系二、DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶相同点催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键不同点模板不需要模板需要DNA的一条链为模板作用对象游离的DNA片段单个的脱氧核苷酸作用结果形成完整的DNA分子形成DNA的一条链用途基因工程DNA复制三、载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：【例题练习】1.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，以便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。据图判断，下列操作正确的是（）A.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割B.质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割C.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割D.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割答案：A解析：由题干信息可知，限制酶Ⅰ能切割—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ不仅能切割—↓GATC—，也能切割—G↓GATCC—。据题图可知，目的基因两端都有限制酶Ⅱ的识别序列（切点是—↓GATC—），可见只有用限制酶Ⅱ才能将目的基因切割下来。质粒上GeneⅠ和GeneⅡ表示两种标记基因，分别能被限制酶Ⅱ识别并切割和被限制酶Ⅰ、Ⅱ识别并切割。如果用限制酶Ⅱ切割，则GeneⅠ和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因；如果用限制酶Ⅰ切割，则会破坏GeneⅡ，保留GeneⅠ，且其产生的黏性末端和切割目的基因后的黏性末端相同，故可以连接形成重组DNA，A正确。（多选题）2.下列关于基因工程工具的说法正确的是（）A.DNA连接酶与限制酶都作用于磷酸二酯键B.DNA连接酶对所连接的DNA两端的碱基序列有专一性要求C.载体能将外源基因导入受体细胞并使其在受体细胞中稳定遗传并表达D.在基因工程操作中，被用作载体的质粒一般都是经过人工改造的答案：ACD 解析：DNA连接酶与限制酶都作用于磷酸二酯键，A正确；DNA连接酶对所连接的序列没有专一性要求，B错误；载体可以携带目的基因进入受体细胞，并经过DNA复制和基因的表达合成相应的蛋白质，C正确；天然的质粒往往不能满足人类的所有需求，故需要对其进行相应的改造，D正确。考点3目的基因的获取一、目的基因1.主要是指编码蛋白质的基因。2.一些具有调控作用的因子。二、获取方法1.从基因文库中获取（1）基因组文库：含有一种生物所有的基因。（2）部分基因文库：含有一种生物的一部分基因，如cDNA文库。2.利用PCR技术扩增目的基因（1）含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。（2）原理：DNA双链复制。（3）条件：引物、DNA模板、Taq酶、四种脱氧核苷酸。（4）过程。①目的基因DNA受热变性后解链为单链（90～95℃）。②引物与单链相应互补序列结合（55～60℃）。③在DNA聚合酶作用下进行延伸（70～75℃）。④重复循环多次。（5）特点：指数形式扩增。3.人工合成法（1）条件：基因比较小，核苷酸序列已知。（2）方法：通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。【技法提升】一、目的基因获取方法的选择（1）如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中去获取目的基因。（2）如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过DNA合成仪利用化学方法人工合成。（3）如果只知道扩增目的基因的两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可以通过PCR技术扩增目的基因。二、目的基因获取过程的比较（1）基因组文库：供体生物→全部DNA→DNA片段→受体菌群→目的基因（2）cDNA文库：供体生物→mRNA→cDNA→受体菌群→目的基因（3）PCR技术：目的基因→大量目的基因（4）人工合成：蛋白质的氨基酸序列→mRNA核苷酸序列→DNA核苷酸序列→目的基因三、PCR技术与DNA复制的比较比较项目DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温下变性解旋场所细胞内（主要在细胞核内）细胞外（主要在PCR扩增仪中）酶解旋酶、DNA聚合酶耐热的DNA聚合酶温度细胞内温和条件控制温度，需55℃～95℃高温结果合成DNA分子合成DNA片段或基因联系（1）模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板（2）原料：均为四种脱氧核苷酸（3）酶：均需DNA聚合酶（4）引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸【例题练习】1.获取目的基因的方法有多种，下列叙述不正确的是（）A.若目的基因的核苷酸序列未知，可从基因库中获得B.可由相应的mRNA逆转录而来C.可由PCR反应扩增D.若目的基因的核苷酸序列是已知的，可用化学合成方法获得答案：A解析：若目的基因的核苷酸序列未知，可从基因文库中获得，不是从基因库中获得，A错误；若目的基因的核苷酸序列已知，如胰岛素基因，采用化学方法合成或用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因，化学合成途径如：利用目的基因转录的RNA，在逆转录酶的作用下，逆转录成单链DNA，进而用PCR技术扩增目的基因，B、C、D正确。（多选题）2.下列关于基因组文库和cDNA文库的叙述，正确的是（）A.基因组文库和cDNA文库中的所有基因都能实现物种之间的基因交流B.基因组文库含有某种生物的全部基因，而cDNA文库含有某种生物的部分基因C.基因组文库中的基因含有启动子和内含子，而cDNA文库中的基因无启动子和内含子D.根据基因中的核苷酸序列、基因在染色体上的位置可从基因文库中获取目的基因答案：BCD解析：基因组文库中的部分基因可以实现物种之间的基因交流，而cDNA文库中的所有基因都能实现物种之间的基因交流，A错误；基因组文库含有某种生物的全部基因，而cDNA文库含有某种生物的部分基因，B正确；基因组文库中的基因含有启动子和内含子，而cDNA文库中的基因无启动子和内含子，C正确；从基因文库中获取目的基因时，可根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取，D正确。考点4基因表达载体的构建与转化一、基因表达载体的构建——核心1.构建基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。（2）使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成两子启动和终止；目的基因在中间；标记基因来筛选。3.基因表达载体的功能（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。（2）使目的基因表达和发挥作用。二、将目的基因导入受体细胞1.转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.转化方法（1）导入植物细胞（1）农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物。（2）基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。（3）花粉管通道法：我国科学家独创的一种方法。（2）导入动物细胞①常用方法：显微注射技术。②常用受体细胞：受精卵。（3）导入微生物细胞①方法a.用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（这种细胞称为感受态细胞）。b.感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子。②受体细胞：原核细胞（使用最广泛的是大肠杆菌）。③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。【技法提升】一、将目的基因导入受体细胞的方法比较生物类型植物动物微生物受体细胞体细胞受精卵原核细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射技术感受态细胞法转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子二、农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA上；第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的TDNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的TDNA导入受体细胞。【例题练习】1.在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是（）①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止④所有基因表达载体的构建是完全相同的⑤必须在细胞内进行A.②③⑤ B.①④⑤ C.①②⑤ D.③④答案：B解析：基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子和标记基因等，①错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子控制着转录的结束，③正确；由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，④错误；基因表达载体的构建必须在细胞外进行，⑤错误。综上，②③正确，①④⑤错误，故选B。（多选题）2.为增加玉米抗旱性，科研人员构建含有水稻抗旱基因E的重组质粒，采用农杆菌转化法转入玉米幼胚组织细胞中，用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交检测后，经进一步鉴定，筛选出抗旱的转基因玉米。下列叙述错误的是（）A.可从水稻基因组文库获得E基因，并通过PCR技术对E基因进行大量扩增B.将重组质粒导入农杆菌时，农杆菌应预先经过NaCl2处理C.用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞，再经组织培养可获得完整植株D.用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，可在个体水平检测转基因玉米的抗旱性状答案：BD解析：根据题干信息可知，目的基因为水稻的抗旱基因，可以从水稻基因组文库中获得目的基因，并利用PCR技术对目的基因进行大量扩增，A正确；一般先用Ca2+处理农杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态，然后再将重组质粒导入其中，B错误；用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞后，再经过脱分化和再分化即组织培养获得转基因植株，C正确；用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，可在分子水平检测转基因玉米的抗旱性状，D错误。考点5目的基因的检测与鉴定一、分子水平检测1.检测转基因生物DNA上是否插入了目的基因。方法：DNA分子杂交技术。2.检测目的基因是否转录出mRNA。方法：分子杂交技术。3.检测目的基因是否翻译成蛋白质。方法：抗原—抗体杂交技术。二、个体水平鉴定包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。【技法提升】一、目的基因的检测与鉴定在不同方面的比较类型步骤检测内容方法结果显示分子检测导入检测目的基因是否导入受体细胞DNA分子杂交技术（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带表达检测目的基因是否转录出mRNA核酸分子杂交技术（DNA和mRNA之间）是否成功显示出杂交带目的基因是否翻译出蛋白质蛋白质分子杂交（抗原和抗体之间）是否成功显示出杂交带个体生物学水平的鉴定①确定是否具有抗性及抗性程度②基因工程产品与天然产品的活性是否相同①抗虫或抗病的接种实验②基因工程产品与天然产品活性的比较是否赋予了预期抗性或蛋白质活性二、常见不同转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法个体水平的鉴定实际上是检测目的基因是否表达出所控制的性状，不同的转基因生物检测方法不同。转基因生物检测方法观察目标抗虫植物害虫吞食害虫死亡抗病毒（菌）植物病毒（菌）感染未侵染上病斑抗盐植物盐水浇灌正常生长抗除草剂植物喷洒除草剂正常生长获取