bcl-2基因转染对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞氧糖剥夺损伤保护作用

第４１卷第４期第４００

华技大学学报医学版ｄ

１２转染对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞氧糖损伤的保护作用＊１，１△，２，目的 研究转染对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞氧糖损伤的保护作用为转染治疗脑血管病寻找实验依据。方法 体外培养新生大鼠大脑皮层神经细胞应用脂转染法将转染入神经细胞，建立氧糖模型实验分为正常对照组氧糖组和转染组转染２４ｈ后进行氧糖采用法ＭＴＴ法流式细胞仪分别检测各组细胞的蛋白表达细胞及凋亡率。结果ＳＤ大鼠大脑皮层神经细胞可纯化体外培养纯度达到９０％以上。成功建立了大鼠神经细胞体外氧糖模型成功进行了质粒ｐｃＤＮＡ的转化扩增及转染。对照组神经细胞２少量表达氧糖组２蛋白微弱表达转染组细胞２蛋白高表达各组间差异均有统计学意义均Ｐ＜０．０１）。ＭＴＴ法检测结果显示对照组细胞的吸光度值为氧糖组的Ａ值为与对照组相比明显降低Ｐ转染组的Ａ值为±低于对照组但明显高于氧糖组。对照组神经细胞凋亡率为４．６％氧糖损伤后细胞凋亡率明显增加，为１９．６％；转染组细胞凋亡率与氧糖组相比有明显下降，为９．６％差异有统计学意义均Ｐ。结论 脂介导的转染对氧糖损伤的大鼠大脑皮层神经细胞有明显保护作用。；神经细胞；转染；氧糖；神经保护号 ２ｎ△ｕｙｎｄｙｄｆ ｙｏｘｙ ｕ Ｄ ４ｅＴｗ ｉ％ ２ Ｄ ｐＰｐｎＤＡｖａｌｐｎＤＤ２ｐ％ ｅｓｔｅ２ｅｎ ２ｎｄｎｍｙｙＯＧＤｉｎ；；；男年生主治医师博士，Ｅｍ等 转染对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞氧 损伤的保护作 脑血管病的治疗是当前神经科学的研究热点之一。中枢神经系统尤其是大脑皮层对缺血缺氧性损伤非常敏感缺血缺氧引起的一系列病理生理变化是缺血性脑血管病神经损伤的重要机制［１２］。本研究通过氧糖法建外神经细胞缺血缺氧性损伤模型利用脂介导的转染技术将ｂ２转染入神经细胞内观察２的神经保护作用为临床应用技术治疗缺血性脑血管病提供实验依据。１材料与方法

定神经细胞一抗为兔抗大鼠抗体二抗１．３大鼠神经细胞体外氧糖模型的建参照［３］莽静［４］等的方法建立氧糖模型模拟细胞的缺血缺氧性损伤。取培养７ｄ的神经细胞吸去原培养液后加入无糖ｓ液将细胞培养瓶置于缺氧罐内向罐内持续通入含有９５％Ｎ和５％ＣＯ的混合气体。通气ｎ后夹闭缺氧罐的置于培养箱内密闭６ｈ，取出缺氧罐吸去无糖ｓ液换回维持培养液放回３７℃５％１．１实验材 ＣＯ２培养箱中继续培养２４ｈ后进行后续实验１实验动 新生出生２４ｈ内雄性ＳＤ鼠由华技大学同济医学院实验动物学部提供。２主要试剂 重组质粒２由巴生物公司提供ＤＭＥＭ高糖培养液胎牛马购自ｅ公司％胰酶、培养液添加剂购自ｏ公司；ｅ脂转染试剂盒购自ｏｎ公司质粒小量提取试剂盒购自德国ｎ公司。兔抗人２单克隆抗体抗兔Ｇ购自碧云天公司。ＲⅤ及ｄⅢＤＮＡ限制性内切酶购自大连公司１．１．３主要仪器超净工作台 安泰公司恒温细胞培养箱倒置相差显微镜荧光显微镜ｓ公司流式细胞仪：ＦＡＣＳｎｎ公司１．２ＳＤ大鼠大脑皮层神经细胞的体外培养与鉴定取新生大鼠冰冻麻醉后用乙醇消毒无菌条件下剪剥头皮颅骨夹取大脑置于冷无菌液中剔除脑膜血管液用眼科剪将脑组织剪成约１３的碎块加入胰酶温箱内消化完全培养液等体积终止消化滴管反复吹打后在ｎ下离心５弃上清加完全培养液５吹打混匀后过目筛网ｎ下离心５弃上清完全培养液重悬细胞吹打混匀后静置，调整细胞密度以Ｌ的密度种植于预先包被有多聚赖氨酸的培养瓶内置于２的细胞培养箱中培养４ｈ后换维持培养液第３天开始在培养液中加入阿糖胞苷作用然后更换培养液以后每周换液２次每次换半量。接种第７天可见神经细胞突起连接成网可用于后续试验。采用神经元特异性烯醇化酶免疫荧光染色鉴

１．４质粒转化扩增及转大肠埃希菌ＤＨ５α感受态及转化质２的转化扩增抽提与纯化分子克隆实验指南第版）［５］操作质粒酶切鉴定及ＤＮＡ分析酶切鉴定参照质粒图谱选用ＲⅤ及ｄⅢＤＮＡ限制性内切酶委托华大科技完成紫外分光光度计定量，计算质粒的浓度及纯度质粒ＤＮＡ的浓度＝。脂介导法进行２转染转染方法参照脂转染试剂盒ｅ说明书进行。经测定实验提取质粒纯度为浓度为可直接用于后续实验。１．５实验分取正常培养至７ｄ的神经细胞随机分为组：正常对照组始终正常培养氧糖组氧糖６ｈ，复氧及２转染组２转染后２４ｈ再进行氧糖。１．６法检测各组２蛋白表达参考细胞培养第２版大致步骤如下９６孔板培养的各组细胞吸弃培养液预冷洗１００μ细胞裂解液冰上裂解２０用细胞刮刮下细胞４℃离心１５吸上清液至管中ｄ法行蛋白定量，取１０μｇ样品加入等体积上样缓冲液混匀２转移至硝酸纤维素膜室温封闭１ｈ后加入一抗兔抗人２单克隆抗体４℃过夜。洗涤加入辣根过氧化物酶标记的二抗抗兔室温１ｈ，洗涤显色。每组实验重复３次利用激光扫描吸光度分析法半定量测定表达。· 技大学学报医学版 １．７各组细胞检ＭＴＴ比色试验法检测细胞参照细胞培养第２版取原代神经细胞细胞计数１×按每孔２００μ接种于孔板培养５ｄ后随机分为正常对照组氧糖组和转染组，每组设５个平行孔。每孔加入（孵育４ｈ，镜下观察形成紫色针状结晶弃去上清每孔加入室温振荡。待紫色结晶全部溶解后在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值检测波长为。收集各组细胞操作方法参照ｎＦＩＴＣ细胞凋亡检测试剂盒说明书进行上机检测

细胞凋亡率１．９统计学分本研究数据采用软件包分析实验数据以±表示。两组间的均数比较采用ｔ检验，多组间均数比较采用中的ｕｎ法以Ｐ＜为差异有统计学意义。２结２．１原代大鼠大脑皮层神经细胞的培养与鉴定大脑皮层神经细胞体外培养至第天可见神经细胞生长旺盛胞体饱满胞核明显突起延长相互间连接成网络图。细胞免疫荧光染色显示胞质及突起显亮绿色荧光阳性为神经细胞图２图 培养至第７天的神经细胞细胞胞体呈圆形或卵圆形胞核明显细胞突起延长相互间连接成网络２ｍ图３神经细胞免疫荧光鉴定同一视野下对应的细胞核荧光细胞核被染成蓝色（ＤＡＰＩ染色，×２００） ２．２重组质粒的酶切鉴定２Ⅲ限制性内切酶双酶切后可见载体约及２条带与目的条带大小一致图对所构建的质粒２进行 并将所测得的序列与序列数据库进行比对，两者结果完全一致说明质粒构建成功。质粒２序列图的一部分见图５。 法检测各组细胞２蛋白表达免疫印迹分析显示对照组神经细胞２有少量表达氧糖组２蛋白仅有微弱表达转染组细胞２蛋白高表达。对照组与转染组相比差异有统计学意义氧糖组与转

００ｂ２ｂＡ）内切酶双酶切电泳图 等 转染对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞氧 损伤的保护作 图５质粒ｂｃｌ的部分序列图ｅ染组相比差异有统计学意义Ｐ氧糖组与对照组相比差异亦有统计学意义Ｐ图

３讨

治疗脑血管疾病是当前神经科学的研究热Ｄ图６法检测各组细胞ｂｃｌ蛋白水平２．５各组细胞及凋亡率检法检测结果显示对照组细胞在５７０ｎｍ处的吸光度值Ａ为氧糖组的Ａ值为与对照组相比明显降低Ｐ２低于对照组Ｐ但明显高于氧糖剥夺组Ｐ。通过流式细胞仪测定正常对照组神经细胞的凋亡率较低为氧糖损伤后细胞凋亡率明显增加为而预先转染ｂ２的转染组其细胞凋亡率与氧糖组相比有明显下降为差异有统计学意义均Ｐ

点然而限于目前的研究水平疗法尚难在临有效运用因此现阶段在体行神经细胞培养构建模拟病理状态下的缺血缺氧性细胞损伤模型并通过把相关转染入细胞后进而观察细胞的功能状态不失为一种较好的研究方法。现已证实缺血性脑血管病发病机制与缺血缺氧性损伤引起的一系列变化有关［７］。氧糖损伤模型是目前普遍应用的体外模拟缺血缺氧性损伤的细胞模型。该模型可模拟脑缺血的许多病理生理特征对于研究神经细胞缺血性损害的机制及神经保护具有重要作用可在缺血损害的过程中直观地评价细胞的功能［３］。２是一种原癌许多研究显示它具有抑制细胞凋亡的作用。但是直接将２转染入体外培养的神经细胞并进行氧糖实验模拟缺血缺氧性损伤以此来研究２的抗凋亡作用的研究甚少。随着治疗研究的日益深入转染载体的作用越来越突出阳离子脂质体是近几年来发展较快的非载体目前的研究认为与载体相比脂具有无免疫原性、易生产质粒免受核酸酶降解和无致瘤性等优点并且作为载体的有效替代物阳离子脂能用于细胞的体内和体外转染。本研究在体外培养大鼠大脑皮层神经细胞应用脂转染法成功将２基因转入神经细胞通过２蛋白的半定量分析证实转染后的２在体外大鼠神经细胞中有高表达。氧糖模拟法目前在体外的细胞培养实验中应用较多通过缺氧无糖培养及之后的复氧它能较好地模拟病理状态下细胞缺血缺氧再灌注损伤的损伤机制本实验氧糖模型组下转第页· 技大学学报医学版 方法仅关注在组中发生了显著改变的少数基因而忽视了整个杂交数据在特定功能集中的表达一致性。为了弥补这一不足本研究同时结合了ＧＳＥＡ方法利用整个杂交数据在特定功能集中的表达一致性这一特点从整体上解读数据中蕴含的生物学信息更好地阐明生物学过程。综上所述本研究表明利用生物信息学的方法能有效地分析 数据从而高效大规模地获取生物内在信息。为进一步深入研究ＩＤＨ１在ＡＭＬ的分子发病机制中的作用提供了基础为进一步的生物学验证提供依据。参 文ｍｕｒｏｐｅａ ｏｆｔｈｅＷＨＯｏｆｌｅ，３］

ｅｅｅ ｓｅｔｃｎｌｍＪｎＮｈ Ｈｎｃｓ ｈｅｏｅｓ［８］ＭＧｔｅ ｎ ［９］ｓＪｎｅ上接第页的细胞Ａ值为及凋亡均较对照组明显下降说明模型的构建是成功的。而在转染２的转染组细胞Ａ值为及凋亡率与氧糖组差异均有统计学意义证明脂介导的２转染可显著降低细胞凋亡率提高细胞活力具有明显的细胞保护作用。本研究成功构建了体外培养神经细胞的缺血缺氧模型证明可以通过脂转染法将２转染入神经细胞内并获得一定的抗凋亡作用。本研究为今后的转染治疗脑血管病提供了实验依据。参 文ＷｐＬｅｉＭｌｒｃ［３］．氧糖离体神经元缺血模型的建［Ｊ］．重庆 学学报［４］莽静 等．大鼠皮层神经元原代培养鉴定及

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