生化检测原理课件

第二部分：Spectrophotometry

Principle分光光度法检测原理

所以：待测物浓度可以由检测其颜色深浅得到。不同浓度，颜色深浅不一。没有颜色？间接：通过生化反应生成有色物质，间接计算得到浓度。双缩脲反应分光光度法的原理基础：Lambert-BeerLaw，I

——入射光及通过样品后的透射光强度；A——吸光度(absorbance)；C——样品浓度；d——光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度；k——光被吸收的比例系数；T——透射比，即透射光强度与入射光强度之比。简而言之，光被一定浓度介质吸收的比例与入射光的强度无关；在光程上每等厚层介质吸收相同比例值的光。为什么需要平行单色光？在非单色光的条件下，由于待测物质在各个波段下吸光系数K的不同，造成相关曲线也出现不同程度的偏离。

实际上，理论上的单色光是不存在的，我们所做的只能是让入射光的光谱带宽尽可能的小，要尽可能的靠近单色光。为什么仅适用一定范围内？

Lambert-BeerLaw在有解离、缔合、生成络合物或溶剂化等会对比尔定律产生偏离。解离是偏离朗伯-比尔定律的主要化学因素，当溶液浓度（大于0.01mmol/L）改变，解离程度也会发生变化，吸光度与浓度的比例关系便发生变化，导致偏离朗伯-比尔定律。前分光模式1、光源灯发出全波段光线2、单色器将全波段光线分为某一波长的单色平行光3、单色平行光经过反应杯溶液4、光电信号接收器检测光线强度后分光模式5、光电信号检测各种光线强度4、衍射光栅将出射光线分为不同波长的单色光3、平行光经过反应杯溶液1、光源灯发出全波段光线2、光线经凸透镜整理成为不同波段平行光分光光度法的分析类型一，终点法1-PointEndAssay2-PointEndAssay二，速率法2-PointRateAssayRateAssay2-pointendassay:检测2个点的吸光度，一点反应启动前样品空白的吸光度，另一点为反应启动后的吸光度。2-PointRateAssay：检测两个不同时间点之间的吸光度之差，除以时间差得到的变化率1个或多个反应试剂检测2个点吸光度用于计算通过Abs/min来计算检测项目的量2-pointRateassay反应图1个或多个反应试剂通过最小二乘法计算反应曲线，得到待测物的量或活性RateA：一定时间连续多次测定反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，间接计算检测项目的量的方法。RateA反应图：检测方法检测物质Examples校准方法1点终点法底物类TG,CHOL2点线性校准2点终点法底物类TP,ALB,Glu，TB,DB,Ca,Pho,UA,HDL,LDL2点线性校准特定蛋白类HSCRP,HbA1c多点非线性校准速率A法酶类AST,ALT,GGT,LDH,CK2点线性校准底物CREAJaffe,UREA,Ammonia,TDM2点线性校准2点速率法底物UREA,ACP，Urinary/CSFprotin 2点线性校准Calibrationqualitycriteria校准限制界面Utility>ApplicationscreenSDLimit(标准差限制):实测吸光度和理论计算吸光度的差异Duplicatelimit(重复性限制):重复性限制,相对范围%和绝对范围Sensitivitylimit(灵敏度限制):空白浓度和c.f.a.s之间的单位浓度吸光度变化差异的最大值和最小值S1AbsorbanceLimit(空白限制):试剂空白就是待测物浓度为0时的吸光度.校准报告CHOStd1,2双波长检测吸光度差Std1,2主波长检测吸光度校准报警校准结果K=(CFAS-0)/(5848-1973)x10000=1120K=(CN–Cb)⁄(AN–Ab)Duplicatelimit:重复性限制检查同一个校准品的两次吸光度差异Abs1-

Ab2校准的时候,每个校准品会重复做两次进行计算原因：如果是新试剂，检查试剂复溶及混匀情况检查样品针和试剂针.样品或试剂上有气泡光源灯或比色杯老化混匀不佳Sensitivitylimit(灵敏度限制)

该数值标识出空白和c.f.a.s之间的单位浓度吸光度变化差异的最大值和最小值.

在终点法的生化项目校准中，最小吸光度变化是必须检测的标准Sen:校准失败校准液（1）吸光度

Standard1Absorbance

S1Abs用于检查线性或非线性校准。报警用于指示第一点校准品吸光度是否超出范围。S1Abs定义校准品1水平的上限和下限。用于检测试剂空白。

校准报警

DUPSENS1AbsLimitCalib.Limit常见报警类型潜在原因DuplicateLimit加样不准(样本、试剂)，搅拌(P)，反应杯光源老旧，环境，电压SensitivityLimit校准品、水点污染，试剂，校准品单位更改未更改数值CalibrationLimitcfas和水空白，加样不准，系统水，光源灯StandardDeviationLimit不正确的加样顺序，光路，针(加样不精确)Standard1Absorbance水质，试剂，光源StandardError仪器，反应过程，其它校准报警造成生化校准报警的潜在可能原因

生化项目检测常用显色指示系统1，NAD+－NADH（NADP+－NADPH）指示系统2，p-NP（磷酸对硝基苯酚）和p-NA（硝基苯酚）指示系统3，H2O2偶联的指示系统4，抗原抗体反应指示系统，免疫比浊法5，其它显色反应

1，NAD+－NADH（NADP+－NADPH）指示系统：反应原理：NADH和NADPH在340nm有特征性吸收峰，而NAD+和NADP+在340nm无特征性吸收峰，利用其偶联的脱氢酶(工具酶)反应，根据340nm吸光度的变化，可以测定物质的浓度或活性。临床项目：ALT、AST、CK、LDH、CK-MB、α-HBDH、Glu（己糖激酶法）、UREA、NH4+、CO2等1.5.2.2.举例说明ALT的测定原理（IFCC）试剂成分和反应公式：R1：NADH、乳酸脱氢酶（LDH）；R2：L-丙氨酸、α-酮戊二酸。原理：NADH的减少，引起340nm吸光度的下降，下降速率与ALT活性成正比(酶动力学法)。2，p-NP（磷酸对硝基苯酚）和p-NA（硝基苯酚）指示系统反应原理：

p-NP和p-NA在405nm有特征性吸收峰，根据405nm吸光度的变化，可以测定物质的浓度或活。临床项目：

ALP、ACP、r-GT、AMY等。举例说明：ALP的测定原理（IFCC）试剂成分和反应公式。R1：AMP缓冲液，镁离子，锌离子，PH＝10.44；R2：对硝基苯磷酸，防腐剂，PH＝8.5原理：在镁离子和锌离子的存在下，碱性磷酸酶解离对硝基苯磷酸形成磷酸盐和对硝基苯酚，引起405nm吸光度的上升，上升速率与ALP活性成正比（动力学法）。3，H2O2偶联的指示系统反应原理：H2O2在过氧化物酶的作用下，可使单一个或成对的无色的色素原氧化成有色的色素，导致某一波长吸光度的增加，因此可用来测定物质的浓度或活性。临床项目：过氧化物酶法CHOL，GLU举例说明:

GLU过氧化物酶法的测定原理R1：4-氨基安替吡啉、抗坏血酸氧化酶R2：葡萄糖氧化酶（GOD）、过氧化物酶（POD）、酚。测定原理：醌亚胺的生成，导致500nm吸光度的增加，增加的程度与Glu的含量成正比。4，抗原抗体反应指示系统，免疫比浊法反应原理：特异性抗体与抗原(待测物质)在相应的缓冲环境下反应生成抗原抗体复合物，形成一定的浊度，导致特定波长透光率的改变。在抗体过剩的前提下，改变程度与抗原浓度成正比。临床项目：

apoAI、apoB、Lp(a)、IgG、IgA、IgM、C3、C4、CRP等。5，其它显色反应TP的反应原理：蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物，导致540nm吸光度的增加，增加的程度与蛋白质的含量成正比。ALB的反应原理：在pH4.2环境中，溴甲酚绿在有非离子去垢剂聚氧乙烯月桂存在时，可与白蛋白形成蓝绿色复合物，导致630nm吸光度的增加，增加的程度与白蛋白的含量成正比。其它的显色反应还有Ca和Mg等物质的测量方法，

c701c702c502/501应用数

•光度200200200•计算检测888•血清指数333分析通量（最大）2000个测试/小时2000个测试/小时600个测试/小时反应体积100-250μL100-250L100-250L反应温度（孵育池）37±0.1°C37±0.1°C37±0.1°C反应杯406池（14区域）406池（14区域）160池（8区域）反应时间1-分钟步骤中3-10分钟

1-分钟步骤中3-10分钟1-分钟步骤中3-10分钟移液循环1.8s1.8s6s复合方法非接触超声混合非接触超声混合非接触超声混合表9-3反应系统反应系统

c701c702c502/501试剂盒类型•cobasc大容量试剂盒•cobascpackMULTI大容量试剂盒•cobasc大容量试剂盒•cobascpackMULTI大容量试剂盒•cobasc中等容量试剂盒•cobascpackMULTI中等容量试剂盒试剂加载/卸载手动自动（试剂管理站进行）

自动试剂识别自动（RFID）试剂管理站中自动（RFID）自动（条码）•最大量试剂盒7070（试剂管理站中附加10个）

60•试剂冷却（试剂盘中）5-15℃5-15℃5-12℃试剂缓冲转子容量-10个试剂盒-试剂卸载托盘容量-12个试剂盒10个试剂盒试剂移液时间安排（最多使用3个时间点）R1：3.6sR2：113.4sR3：307.8sR1：3.6sR2：113.4sR3：307.8sR1：3.2sR2：90.2sR3：300.2s试剂移液量5-180μL、增加幅度为1μL（5-19μL：+20μL水）质控品剩余试剂体积移液LLD与自动检测读数移液LLD与自动检测读数表9-4试剂系统试剂系统

c701c702c502/501样品类型•血清／血浆•尿•脑脊液•上清液•其他•血清／血浆•尿•脑脊液•上清液•其他•血清／血浆•尿•脑脊液•上清液•全血•其他样品移液量1.5-35µL，每次增加0.1µL样品堵塞探测压力灵敏式凝块探测系统液面传感器电容传感技术表9-5取样系统取样系统

c701c702c502光源卤素灯，12V/50W光度计多波长分光光度计波长12种波长可供选择：340，376，415，450，480，505，546，570，600，660，700，800nm光路长度5.6mm光程吸光度0.0000-3.3000线性吸光度不高于2.5光模式单色光和双色光光度测定系统光度测定分析的流程1清洗反应杯启动后，机械部件将重设并回位。仪器开始进行反应池冲洗。反应盘持续旋转。冲洗喷嘴A

从反应池吸取反应混合物。数个循环后，通过冲洗喷嘴B/C，使用去离子水对反应池进行清洗。下一步，使用CellCln1，于冲洗臂中，通过喷嘴D/E

对反应池进行清洗。使用CellCln2，于冲洗臂中，通过喷嘴F/G

对反应池进行清洗。使用冲洗喷嘴H/I，对反应池进行去离子水的冲洗。使用喷嘴J/K，再次用去离子水对反应池进行冲洗。2水空白管理冲洗喷嘴L分配排出水空白。一个水空白样品测定3次。如果水空白值与反应杯空白值的差异达到或超过0.1，则不得将该反应杯用于分析试验。3分配样品冲洗与水空白测定后，反应池返回至取样位置，并开始进行样品分发。每间隔