生物化学 第5章 核酸(2)课件

第五章核酸（nucleicacid）(下)

二DNA片段的核苷酸顺序测定

有二种极为有效的方法：链终止法(chain-terminationmethod)和化学裂解法.链终止法是利用5‘-脱氧核苷三磷酸（5’-dNTP）的类似物2‘,3’-双脱氧核苷三磷酸（2‘,3’-ddNTP）取代正常的底物。在DNA合成过程中，当2',3'-ddNTP参入到延长链中时，DNA的合成便终止。由于链终止的部位是随机的，所以可以获得任何一种长度的DNA片段，然后通过凝胶电泳分离，并进行放射性自显影，即可从自显影的胶片上读出DNA片段的核苷酸顺序。

分四组,每组加入四种5‘-dNTP(其中一种含放射线标记)和一种2',3'-ddNTP,并加入E.coliDNA聚合酶Ⅰ,满足DNA合成所需条件,进行该片段互补链的合成。当加入的2',3'-ddNTP参入到链中后,因该类似物脱氧核糖的C-3’位上无OH,不能与下一个核苷酸连接,故链的延长被终止。例如，加入5'-dGTP类似物ddGTP,则链的延伸会在鸟苷酸残基处终止。

第四节RNA的结构与功能

RNA的类型和一般结构特征除某些双股病毒RNA外,其他都是单股分子,但RNA分子可通过自身的回折,在分子内部形成局部的双螺旋区.

RNA局部的双螺旋结构与DNA的A-型结构相似，每轮螺旋约有11个bp.

一mRNA的结构特征mRNA存在于细胞质中,是基因的细胞质信使,直接指导蛋白质的合成。

（一）非翻译区和Shine-Dalgarno顺序

在原核生物mRNA起始密码子AUG上游约10核苷酸处,有一段富含嘌呤核苷酸顺序,该顺序称为前导顺序(Leadingsequence)。因ShineDalgarno首先发现,故又称为Shine-Dalgarno顺序，简称SD顺序。该顺序与翻译起始有关，是核糖体小亚基16SrRNA结合的部位。（三）3'-端多聚腺苷酸结构

在真核生物中,成熟的mRNA3'-端有一段长约50—100个或更长的腺苷酸(polyA)尾链结构。然而它的前体的3'-端只有一段保守的AAUAAA结构，成熟的mRNA3'-端的polyA结构位于这段保守序列下游约10-30个核苷酸处。显然，这段序列为腺苷酸的酶促转移、加到它的3'-端提供了加入点（或信号）。3'-端polyA结构可以提高真核生物mRNA的稳定性。tRNA的二级结构的两个主要特征是：

1氨基酸臂：5'端和3'端碱基互补配对形成7个bp的臂。因该臂的3'端具有共同的、能与氨基酸结合的－pCCA－OH结构，故该臂称作氨基酸接受臂（acceptorstem）或称氨基酸臂。

2反密码环：在与氨基酸臂相对的另一端，有一个由7个碱基组成的突环。该突环因顶端含有能识别mRNA密码子的反密码子，故把这个突环称为反密码环。反密码环通过反密码臂与tRNA的其他部分连接。

3TψC环：在三叶草结构的右侧有一个由七个氨基酸残基形成的突环，因为其中含有假尿嘧啶核苷酸ψ，所以称为TψC环。

4二氢尿嘧啶环（D环）:在三叶草结构的左侧有一个由8－12个氨基酸残基形成的大突环，因为其中含有二氢尿嘧啶核苷酸，所以称为D环。

5可变环（额外环）：在TψC环和反密码环之间有一个可变环，不同的分析不同的tRNA具有不同的可变环，所以是tRNA分类的重要标志。分析不同来源的tRNA结构后发现，约有15个碱基的位置总是不变的，大约有8个碱基的位置是半不变的。这些不变或半不变的碱基大多数出现在可变环中。

（二）tRNA的三级结构

tRNA可以在二级结构的基础上进一步折叠形成倒L－行的三级结构。tRNA复杂的三级结构是由于广泛堆积作用和螺旋臂间的碱基配对来维持的。氨基酸的接受部位和反密码子部位分别位于倒L-型的两端。tRNA狭长部分的宽度约为0.2-0.5nm,这是它们生物学功能所必需的。因为当蛋白质合成时，两分子的tRNA必需同是结合在mRNA的两个密码子上。

tRNA的复杂的三级结构是由广泛堆积作用和螺旋臂间的碱基配对来维持的。在这些相互作用中所涉及的大多数碱基都属于不变和半不变的，这为所有tRNA都有相似构象提供了基础。

E.coli16SrRNA的结构

二、核酸的紫外吸收特征核酸含有嘧啶碱和嘌呤碱基，因而DNA和RNA在紫外光区具有吸收特性，其最大吸收在260nm处。利用核酸和蛋白质紫外吸收差别，可鉴定核酸制品中蛋白质杂质。例如，纯净的DNAA260:A280的比值大约介于1.65～1.85.若比值过高，则表明污染有RNA,比值过低则表明有蛋白质或酚污染。

当DNA在溶液中处于天然状态时，由于双螺旋的刚性以及长长的线性结构，天然DNA的粘度很大，即使稀溶液其粘度也很大。DNA变性后，由于双螺旋的刚性失去，氢键断开，两条链彼此分开，单链分子处于随机卷曲状态，因而粘度急剧下降。因此，DNA粘度的改变，可作为DNA分子变性的重要指标。

在核酸变性实验中，常引用摩尔磷消光系数。摩尔磷消光系数是指含磷为1.0摩尔浓度的核酸水溶液在260nm处的消光值,用ε(p)表示：

ε(p)=A260／C·L=A260×30.98／W·LA:被测核酸样品的消光值；C:每升溶液中磷酸摩尔数；W:每升溶液中磷的重量；30.98是磷的原子质量；L:比色杯的内径。

核酸变性时，ε(p)值就会大大升高，当复性时，ε(p)便降低或恢复到原来的水平，故ε(p)可作为核酸变性与复性的重要指标。

三核酸的沉降特性和浮力密度：

（一）核酸的沉降特性：核酸沉降的速度与它的分子大小及形状和结构有关。核酸的沉降系数(S)与分子量之间呈现对应关系。由于分子的构象对它的沉降特性有很大的影响，故这种对应关系只是相对一定的构象而言，若分子量相同，其构象不同，则S就不同。同一种DNA，变性后的S要比天然的大。沉降系数:大分子在单位离心场中的沉降速度是个定值称为沉降系数.用s（小写）表示。蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数介于1×10－13

～100×10－13之间，为方便起见，将10－13作为一个单位，称为斯维得贝格单位或称沉降系数单位，用S（大写）表示。5S,就表示该分子的沉降系数是5×10－13。1963年J.Vinograd等人从多瘤病毒中分离出高纯度的DNA在进行超速离心时得到20S、16S和14S三条不连续的带，由于是高纯度的DNA，每一条带就应当相当于同一种分子的不同结构形式。研究发现20S代表该分子的超螺旋形式，16S代表该分子的松弛开环形式，14S代表该分子的线型双螺旋形式。（二）DNA的(浮力)密度(buoyantdensity)

把DNA放在密度梯度介质的上面，以相当高的速度离心时，DNA在梯度中迁移，直到达到同它自己的密度相同的部位为止，即漂浮于介质的某一密度梯度中，该部位称作DNA的(浮力)密度。不同的DNA具有不同的(浮力)密度。可利用(浮力)密度的差别，借助密度梯度超离心法来分离制备DNA。DNA的(浮力)密度与其分子的碱基组成有密切的关系，与G·C含量在一定范围内(20%--80%)呈正比关系。Schidkrautetal.导出了下面公式：ρ=1.660+0.098(G+C,)

DNA的(浮力)密度与其分子构象有密切的关系，与分子大小无关。

DNA变性后，分子卷曲成致密的线团，故比天然DNA的(浮力)密度大。四DNA的变性与复性（一）DNA的变性

在水溶液中，双股DNA分子在某些物理因素或化学因素的影响下，双螺旋结构中的碱基堆积力和碱基对间的氢键受到破坏，严密的双股螺旋变成了两条单一的随机卷曲的多核苷酸链，该现象称作DNA变性。

热变性是DNA的一个极其重要的性质，在研究DNA时常用到这一性质。若将DNA稀溶液加热到80℃左右几分钟，双螺旋结构就会受到破坏，氢键逐步断开，形成无规线团。这种变化叫做螺旋→线团转换（helix-coiltransition）.增色效应：

当DNA溶液慢慢加热到双螺旋开始解链前，在260nm处的吸收基本保持不变。但当温度达到一定高度(一般在750C以上)时，紫外吸收急剧增加直到两条单链完全分开成随机卷曲状态为止。紫外吸收随变性程度加剧而升高的现象称为高色效应或增色效应(hyper-chromoceffect)。一般来说，DNA分子变性后，紫外吸收增高30—40%。

减色效应

任何多聚核苷酸在260nm处都有一个特征性的紫外吸收的最大值，但这种吸收在天然DNA分子中，由于碱基的堆积而受到抑制，比组成双螺旋分子的两条单链处在随机卷曲状态的吸收或核苷酸单体的总吸收要低得多，这种现象称作低色效应或减色效应(hypo-chromiceffect)。

在热变性过程中，双股螺旋被解开一半的温度称为解链温度或融解温度(meltingtemperature)或转换温度(transitiontemperature)，用Tm表示。

DNA变性后的性质改变：

1增色效应：指DNA变性后对260nm紫外光的光吸收度增加的现象；2旋光性下降；

3粘度降低；4生物学功能丧失。影响DNA变性（Tm值）的因素

1DNA均一性同质DNA均一性高，变性的温度范围越窄，异质DNA变性的温度范围较宽。据此可分析DNA的均一性。

2G-C含量与Tm值成正比。不同DNA分子的Tm差别与其碱基组成有密切关系。在标准条件下，Tm与DNA碱基组成间的关系：

Tm=69.3+0.41(G+C)

3介质中离子强度离子强度高，Tm高。测定Tm需要特定的条件：即在0.15mol/LNaCl–0.0l5mol/L的柠檬酸钠(1×ssc)溶液中。（二）DNA的复性

DNA在变性后，慢慢冷却，两条单链则可重新结合,回复到双螺旋结构，这一过程称为复性(renaturation)。复性的温度不能太低，一般比解链温度低250C左右为宜。

影响DNA复性速度的因素有：1DNA的大小：DNA片段小的比大的容易复性，信息含量少的比信息含量多的容易复性。2离子强度：介质中离子强度对DNA复性有很大的影响，增加介质中的盐浓度，两条互补单链重新结合的速度快。

3DNA浓度：DNA浓度大，两条互补单链彼此相遇的可能性大，重新结合的速度快。复性的速度服从二级反应动力学，即重组合的速度与两条单链的浓度成正比：－dC/dt＝kC2(1)

这里,C是t时间的单链DNA的浓度,以每升(L)中核苷酸的摩尔(mole)数表示；t是以秒(s)表示的时间,k是二级反应的速度常数,k值取决于阳离子浓度﹑温度﹑片段大小以及DNA序列的复杂性.(1)式可改写成:

－dC/C2＝k·dt

在反应初始时,t＝0,C＝Co,积分得到:

（1/C）—（1/Co）＝ktC/Co＝1/(1＋kCo·t)(2)

在反应初始时,由于t＝0，所有的DNA都是单股,所以Co是总DNA的浓度,Co是已知的,C是可以测定的。在固定的条件下(DNA片段的大小﹑温度﹑pH及离子强度),当C/Co＝1/2时,则(2)式为:1/2＝1/(1＋kCo·t1/2)

Co·t1/2＝1/k(3)

因此,Co·t1/2定义为重结合(复性)反应进行到一半时的Co·t值.

Co·t1/2是二级反应速度常数k的倒数。由于其他条件都可以固定,那么Co·t1/2可以作为DNA序列的复杂性的一种量度。Co·t1/2越大,DNA复杂性就越高。对于那些不含重复序列的生物来说,其复杂性可以用来表示基因组的大小。细菌DNA的Co·t1/2比病毒的大,因而细菌DNA比病毒DNA更复杂,基因组也大得多。

由于Co·t1/2定义为重结合(复性)反应进行到一半时的Co·t值,因此可以用它来衡量复性的速度。Co·t1/2的乘积小,表明复性所需的时间少,复性的速度就快.DNA复性以核苷酸对确定基因组的大小复性速度小鼠卫星小鼠卫星小鼠卫星在起始浓度相同的情况下，

1大肠杆菌DNA的Co·t1/2

约为9mol·L-1·s，而T4噬菌体DNA的Co·t1/2约为0.3mol·L-1·s.这表明，T4噬菌体DNA比大肠杆菌DNA复性速度快30倍。DNA分子信息含量愈大，复性所需要的时间就愈长。由于大肠杆菌DNA分子比T4噬菌体DNA分子大得多,即结构和信息含量比T4噬菌体DNA复杂的多,在溶液中核苷酸总浓度相同的条件下,大肠杆菌DNA互补单链数就比T4噬菌体DNA少得多,扩散的阻力也大得多,因而复性的速度就慢得多。

2哺乳动物基因组Co·t1/2约为104mol·L-1·s。若实验所用的DNA的浓度为10-4mol·L-1，则需要108秒才能达到104mol·L-1·s，即需要约三年的时间才有一半重新结合。在复性实验中还发现，约有10％的小鼠DNA的复性速度比病毒DNA的还要快。这表明小鼠DNA含有很多的重复顺序。因为在某一DNA内只有同时存在很多相同或很相似的顺序，才能很容易找到互补顺序。

用DNA复性动力学的方法业已证明真核生物染色体DNA存在有高度重复顺序，中度重复顺序和单一顺序.（三）DNA印迹

变性DNA在一定条件下的重结合，也能在不同来源的两条DNA单链之间进行，甚至可以在DNA和RNA之间进行。但是,DNA-RNA杂交双链的稳定性低于相应的DNA双螺旋。因为重结合是以互补碱基顺序为基础的，只要在两条单链之间存在有互补顺序(虽不是整个顺序)就可以相互结合形成双链。所以，在DNA变性和复性的基础上建立了一种非常有用的技术---分子杂交(molecularhybridization)。利用分子杂交技术可以分离蛋白质的基因,研究基因的转录和调节控制。近年来，分子杂交技术已经广泛地应用于DNA分子信息含量以及不同DNA分子的亲缘关系的测定。

E.Southern发展了一种很有用的方法可以用来鉴定具特定顺序的DNA。这个方法称作Southernblot(DNA印迹)。DNA印迹法可以扩展用于特定RNA的鉴定。将RNA采用与DNA印迹类似的程序,可以用互补的、具放射性标记的RNA或DNA探针与其杂交。为了与DNA印迹法相区别,一语双关地把这种检测RNA的方法叫做NorthernBlot(RNA印迹)。特定的蛋白质也可采用类似的程序进行鉴定.所不同的是,所用探针是与该目标蛋白的抗体.这种方法叫做WesternBlot或Immunoblot(蛋白质印迹或免疫印迹)。

DevelopedbyE.M.SouthernSouthernblottingdetectsspecificDNAfragments(detectsspecificrestrictionfragmentsinacomplexmixtureoffragments)Canbeusedfortheestimatingtheofgenecopiesinthegenome,restrictionmappingofgenomicfragments,detectionofclonedsequences,detectionoftransgenes,detectionofhomologoussequencesindifferentgenomesetc.Southernblot

第六节核酸的水解

一核酸的酸水解和碱水解

（一）酸水解

DNA和RNA的C－N糖苷键对稀酸的敏感程度是不同的。RNA对稀酸不敏感。DNA嘌呤碱基所连接的C－N在稀酸条件下，很容易被水解。（二）碱水解在碱性条件下，RNA很容易被水解，得到2’，3’－核苷酸混合物。进一步水解还可以得到核苷。DNA不能被碱水解。

三核酸的酶水解

能水解核酸的酶叫做核酸酶(nucleases)。所有的细胞都含有不同的核酸酶。核酸酶属于磷酸二酯酶(phosphodiesterases)，因为核酸酶催化的反应都是使磷酸二酯键水解。由于多核苷酸链内部每个磷酸基涉及与两端的两个糖残基的C-3′位和C-5′位的-OH形成磷酸二酯键,酯键可能是在磷酸基的3‘-端或者5’-端被水解,因而产物的3‘-端或5’-端含有磷酸基。有些核酸酶的作用部位是位于多核苷酸链的内部,这样的核酸酶称为核酸内切酶(endonucleases)；有些核酸酶是从核苷酸链的一端依次水解产生单核苷酸，这类酶称为核酸外切酶(exonucleases)。为了简单图示核酸酶的水解部位,水解发生在磷酸基3'-端者用a表示,磷酸基留在相邻核苷酸的5'端；若水解发生在磷酸基的5'-端者用b表示,磷酸基则留在相邻核苷酸的3'端。（一）核酸酶的专一性

象大多数酶一样,核酸酶对它们所作用的底物具有不同的选择性。只作用DNA的酶称为DNA酶(DNases),只能催化RNA水解的酶称作RNA酶(RNases)。有些核酸酶的专一性差,它们既作用DNA,又能作用于RNA,这类酶称为非专一性核酸酶,例如核酸酶SI(nucleaseSI)即是这样一种酶。

有的核酸酶或许只对单股核酸(ssRNA或ssDNA,ss表示单股)表现出专一性,有的核酸酶可能只作用于双股核酸(dsRNA或dsDNA,ds表示双股)。有些核酸酶可能对多核苷酸链中的碱基具有不同的选择性,因而表示出不同的专一性。

有的核酸酶只能识别特定的碱基顺序,并在该顺序内降解核酸,例如前面介绍的DNA限制性内切酶。（二）核糖核酸酶

胰核糖核酸酶A（RNaseA）催化核糖核酸多核苷酸链内嘧啶核苷酸C-3′位磷酸基与相邻核苷酸C-5′位-OH之间的酯键(即图5－25所示的b部位),产生3'-端含磷酸基的寡核苷酸片段。该酶活性部位的两个His残基(His12或His119)以协同的方式进行广义的酸-碱催化。由于RNaseA分子内含有4个二硫键,极大地稳定了它的结构,因而该酶是比较耐热的一种酶,即使在100℃下亦能表现出它的活性。

枯草杆菌含有一种与RNaseA作用专一性相似的RNase,也是一种b–型内切酶。但是该酶切割的是嘌呤核苷酸C-3′位磷酸基与相邻核苷酸C-5'-OH之间的酯键,因而产物的3'-端含有嘌呤核苷酸。

从米曲酶(Aspergillusoryzae)中分离的核糖核酸酶T1(RNaseT1)是专门水解RNA多核苷酸链鸟苷酸所在部位的酯键的一种b-型内切酶,产物是3'-端含有鸟苷酸的寡核苷酸片段。核糖核酸酶T2(RNaseT2)是与RNaseT1同一来源的一种内切酶,也是一种b-型酶.但它作用的产物是3'-端含有腺嘌呤核苷酸的片段.

上述这些核糖核酸酶可以用来测定较短的RNA片段的核苷酸顺序。例如一段RNA片段,分别用RNaseA和RNaseT1处理后,获得如下的信息:RNaseA处理:C、U、G、AGAURNaseT1处理:AUG、CUAG

根据这两组碎片的碱基顺序的重叠情况,即可以确定该片段的核苷酸顺序是CUAGAUG,而不是AUGCUAG.（三）脱氧核糖核酸酶

一般来说,脱氧核糖核酸酶(DNases)能催化单股的或者双股的多聚脱氧核苷酸链降解。从牛胰中分离的DNaseⅠ是一种a型内切酶，其产物的5'-端含有磷酸基,并对嘧啶和嘌呤核苷酸之间的磷酸酯键表现出某种程度的优先.在低浓度下,这个酶可以用来使dsDNA随机地在内部位置产生具有游离3'-OH的缺口(“nicks”)。具有缺口dsDNA是体外合成具有放射性标记的DNA分子的前体,可用于DNA的顺序测定,并在分子生物学研究中有不同的应用。

DNaseⅡ是一种b型内切酶,产物是3'–端含磷酸基的寡核苷酸片段.从动物的胸腺和脾脏中都可以分离到这种酶.（四）蛇毒磷酸二酯酶和脾磷酸二酯酶

蛇毒磷酸二酯酶(VPD或VPDase)和脾