手性化合物色谱优化课件

1、使用纤维素三（3 - 氯-4 - 甲基苯基氨基甲酸酯）作为手性选择剂和 极性有机流动相来优化手性酸性化合物对映体分离的液相色谱 生物化工 丁达繁 3140221三、材料和方法3一、摘要1二、引言2四、结果与讨论4五、结论56目录一、摘要 利用含氯纤维素手性固定相和极性有机流动相来行优化手性酸性和两性药物对映体的液相色谱。流动相的主要溶剂是乙腈，将温度固定在25C，固定相以纤维素三（3 - 氯-4 - 甲基苯基氨基甲酸酯）作为手性选择器。在筛选步骤中酸性和碱性添加剂的性质和浓度都发现对保留，选择性和分离有显著影响。乙酸（ACA）被选定为酸性添加剂，因为它可比三氟乙酸（TFA）和甲酸（FA）使更多

2、的酸性化合物的对映体分离。测试的三种基本的碱性添加剂中，二乙胺（DEA）比丁胺（BUA）和三乙胺（TEA），对于对映体分离和选择性，有更好的效果。优化是采用面心中心复合设计有两个影响因素，即浓度为（0.1-0.3）的乙酸和浓度为（0.01-0.1）的二乙胺（DEA）。二、引言 手性许多影响都与手性药物的对映体可以具有不同的药理活性有关。手性药物的对映体的生产以及对映体的组成的控制和判定，已经成为制药业和监管机构的关键问题。因此，许多分析和制备技术已经开发了用于手性化合物的对映体分离。在这些技术中，液相色谱（LC）已成为这些分离的必备工具。 尽管大多数的对映体分离的可在液相色谱中的手性固定相来进

3、行，但是应当强调的是，不存在通用的手性固定相。因此，目标手性药物的分离依赖于手性固定相（CSP）和液相色谱（LC）流动相之间适当组合的选择。 已经报道的文献中，使用的多糖基的手性固定相在正相，反相或极性有机流动相模式中，并不包括酸性或碱性添加剂的流动相的重要作用。然而，这些添加剂的性质和浓度已经显示出影响手性化合物的保留，选择性和对映体分离。因此，除了使用各种手性固定相，选择不同的酸性或碱性添加剂对对映体选择性很大的影响，这在极性有机相中使用含有氯纤维素基的手性固定相的碱性化合物的对映体分离上已经有所体现。 1、试剂和仪器 卡布洛芬，苯氧苯丙酸，氟比洛芬，酮洛芬，酮咯酸，2 - 苯基丙酸，2

4、-苯氧基丙酸、丙谷胺、吲哚洛芬， 布洛芬、氯噻酮、甲酸（FA）和乙酸（ACA）、三氟乙酸（TFA）、二乙胺（DEA）、三乙胺、丁胺（BUA）、乙腈（ACN）等 色谱系统等 三、材料和方法 2、解决方案 实验所使用的流动相由乙腈，酸性添加剂（TFA，FA或ACA）和碱性添加剂（BUA，DEA或TEA）的合适比例（体积/体积）混合制备的。 3、色谱条件 流动相是含有酸性和碱性添加剂的乙腈以1.0 mL/ min恒定流速构成的。进样量为20微升。分析物在240nm处进行检测，温度固定在25C。4.1.2乙酸浓度在流动相中的影响 假设在流动相中增加乙酸的浓度（0.050.2），将会减少分析物对映体的保

5、留。除了氯噻酮和氧氟沙星之外所有研究的12种化合物对这个假设进行了验证（见表2）。此外，在流动相中所测试的化合物增加乙酸浓度会轻微改变对映体分离的值。然而，这种增加似乎主要是峰值效率的提高，而选择性值几乎不变。显然乙酸在流动相中的浓度是考虑到在优化步骤的一个重要因素。 4.1.3 碱性添加剂的性质和浓度在流动相中的影响 在表3中可以看出，保留、选择性和对映体分离的值，与含有0.2乙酸的移动相中的碱性添加剂的性质有着重要关系。值得注意的是，除了氧氟沙星之外，含有丁胺总是获得最高的保留值而用三乙胺的最低。图2（B）是具有三个基本的添加剂的2 - 苯基丙酸和2 - 苯氧基丙酸的色谱图，观察到两种酸性

6、化合物保留总趋势丁胺 二乙胺 三乙胺，而这两种化合物对映体分离和选择性是完全不同的。 2-苯基丙酸的对映体分离受到碱性添加剂的性质强烈地影响，在丁胺或三乙胺存在下几乎完全丧失。与此相反，碱性添加剂的性质对2-苯氧基丙酸的对映体分离几乎没有影响。 以二乙胺作为碱性添加剂的流动相中，6种化合物（非诺洛芬，布洛芬，酮咯酸，氧氟沙星，丙谷胺和2 - 苯氧基丙酸）对映体完全分离，而从氟比洛芬，吲哚洛芬，酮洛芬和2-苯基丙酸是部分对映体分离。相反，用三乙胺作碱性添加剂时只有四个手性酸性化合物（氧氟沙星，酮咯酸，丙谷胺和2 - 苯氧基丙酸）完全分离。所以，优化步骤中二乙胺被选定为碱性添加剂。4.2优化 在流

7、动相中酸性和碱性添加剂的的比例对用3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯作为手性固定相的酸性化合物的对映体分离和选择性有显著影响。这些化合物的对映体分离优化，进行了两个定量因素，即在流动相中，乙酸和二乙胺比例。4.2.1多元方法 所选的定量影响因素进行优化，使用面心的中心复合设计。选择三个层次用来估计为每一个因素二次影响的必要性。二次回归模型应用于以观察除了主要的影响外的可能二次和互动影响.该模型由下面的二阶多项式方程表示： 其中y是响应对映体分离或选择性;1和2（系数为线性的影响），11和22（系数为二次影响），12（系数的交互影响），0（截距）和（误差项）;X1和X2是两个因素（分别是乙酸和二乙胺

8、在流动相中的比例）。 合适模型的质量系数测定（R2）的评估，它的分数反应的变化由模型预测的。R2中得到的所有值均在0.85-0.99范围，这表明预测是符合的。部分对映体分离的变化，可以由模型预测的，即Q2，始终保持高于0.69以上，这意味着对映体分离的变异性的至少有69可以被预测的。 氟比洛芬的最大分离可以用比例最高乙酸和近0.07二乙胺获得（图3A)。布洛芬响应面的分析结果是最大对映体分离值可通过乙酸的最低比例和接近0.07二乙胺得到（图3B）。流动相的两种添加剂的最低比例来得到氧氟沙星的最佳对映体分（图3C)。 在最佳的色谱条件下九个测试的化合物中得到的保留和对映体分离（表4），实验中观察到的分离值与那些从模型预测的进行比较，在大多数情况下还是比较接近的。 在表4中，研究的九