形态观察方法课件

1、第三章 细胞生物学研究方法进行初步观察形成可验证的假说设计对照试验收集资料解释结果作出合理结论查阅已有知识生物学研究模式生物第三章 细胞生物学研究方法细胞形态结构的观察方法光学显微镜技术电子显微镜技术 扫描遂道显微镜细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、光学显微镜技术light microscopy普通复式光学显微镜技术荧光显微镜技术 p53激光共焦扫描显微镜技术 p53相差显微镜 p51微分干涉显微镜 p51录像增差显微镜技术倒置显微镜暗视野显微镜显微镜发展趋势重要的光学技术参数光镜样本制作采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。电

2、子显微镜的基本知识主要电镜制样技术扫描电镜二、电子显微镜技术 electron microscopy电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造 1940年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜。直到1965年，才有英国剑桥科学仪器有限公司生产出实用性强的商品扫描电镜。由于扫描电镜具有显著的优点，广泛应用于生物学、医学、古生物学、地质学、化学、物理学、电子学以及勘察、冶金，机械与轻工业等领域，成为十分有用的研究工具。三、扫描遂道显微镜 （ scanning tunneling microscope ，STM）原理：量子力学中的隧道效应，原子间作用力、磁力、摩擦力等装置：扫描的压电

3、陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据 采集、处理、显示系统。特点：1、可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，分辨本领高 （侧分辨率为0.10.2nm，纵分辨率可达0.001nm） 2、可在真空、大气、液体等多种条件下进行非破坏性测量 3、可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息 4、可连续成像，进行动态观察用途：纳米生物学研究领域中的重要工具 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） 原理 应用： 用激光作光源，排除焦平面以外光的干扰，逐点、 逐行、逐面快速扫描，增强图像反差。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微

4、镜，能扫描不同层次，形成 立体图像。微分干涉显微镜 （differential-interference microscope）偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器录像增差显微镜技术 （video-enhance microscopy） 计算机辅助的微分干涉显微镜可在高分辨率下 研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动p51电镜与光镜光路图比较终像（眼或底片）目镜投影镜物镜样品聚光镜荧光屏成像中间像电子显微镜的基本构造主要电镜制样技术超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 负染色技术（Negative staining）重

5、金属盐对铺展在载网上样品染色，干燥后衬托出样品的精细结构金属投影冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching）电镜三维重构技术整装细胞电镜技术 是观察细胞骨架的处理技术。石蜡切片技术取材固定脱水包埋切片脱蜡复水染色脱水透明封片观察步骤： 基本构造：光学放大系统、照明系统、机械和支架系统 光学显微镜成像原理天然物质经紫外线照射后发荧光的物质，如叶绿素能发出血红色荧光。 激光作扫描光源 扫描焦平面上样品，得样品切面像 载物台上微量步进马达使载

6、物台 上下移动,改变焦平面 得不同层次的切面图像计算机图像三维重组获样品立体图像 显微CT 细胞内的各结构可因密度不同而产生相位差(即光程差)，不过人眼无法鉴别这种微小的变化。相差显微镜能够把透过标本的可见光的光程差或相位差，变成振幅差，提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。可用于观察活细胞 。相差显微镜 （phase-contrast microscope）环形光阑(annular diaphragm)：位于 光源与聚光器之间。2. 相位板(annular phaseplate)： 物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4，将直射光与折射光分开。在构造上，

7、特殊:1953年诺贝尔物理奖通过致密部分(如细胞核),速度慢通过疏松部位(如细胞质),速度快相位差(光程差)振幅差(明暗差)相差显微镜刀锋样品液态氟利昂液氮低温刀样品断裂示意图升华蚀刻碳铂用金属和碳喷镀，消化样品收集复型膜于载网上，置电镜下观察快速冷冻低温断裂蚀刻复型原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等， 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术

8、。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学。 是研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。Drosophila melanogasterArabidopsis thaliana植株小 -15 cm种子多- up to 10,000 seeds in a plant周期短- 4 weeks for a cycle基因组小 -5 chromosomes 140，000 kb（基因组测序完成） 紫外线为光源，照射被检物体发出荧光，在显微镜下观察形状及所在位置。 首先汞灯发出紫外线，经第一次滤光片除去较长的波，使紫外线照到样品上。目镜下方滤光片除去紫外线

9、，使可见光通过，以保护眼睛。电子显微镜原理以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50-120KV)的平方根成反比。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2m、光学显微镜下无法看清的结构， 又称亚显微结构（submicroscopic structures）。1. 普通光学显微镜玻璃透镜的工作原理原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。1 数值孔径（镜口率）NA：指光镜的汇聚能力， N.A = n sin/2 注：

10、-镜口角， n-介质折射率。 空气-1、水-133、香柏油-1515、溴萘-16 镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线，与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度。 角小于180，/2小于90，sin/2最大值不超过1，因此NA不会超过1。目前最好的显微镜=140 一般的显微镜上标明10 /0.65、0.75、0.8等，就是指数值孔径，其大小代表了光镜汇聚光线的能力，大，张角大，光通过的多、亮，透性好清晰光学显微镜物镜的特性 人眼的分辨能力在0.2 mm左右，因此光学显微镜的最大有效放大倍数（使用油镜）是1,000到1,400。2 分辨力/率（resdving power）：R， 指25cm明视距

11、离处，能分辨清楚尽可能靠近的两个质点的能力。辨认两点之间的距离越小，则分辨本领愈高。人裸眼的分辨力约为100m，（实际上200m才是理想的）。而显微镜分辨力则以下公式计算： R =061/N.A -光源的波长 可见光波长=0.45m， /2=70， sin/2=0.94 空气折射率n=1，香柏油n=1.5 空气 R = 0.61 /N.A =0.61*0.45m / （1 *0.94）=0.3m 香柏油R = 0.61*0.45m / （1.5 *0.94）= 0.2m 光镜分辨率的最小数值为0.2m。波长是定值（400nm700nm），后者情况如何呢？如何提高显微镜的分辨率？R =061/N

12、.A高的分辨力（R值小）-波长， 镜口率。 NA 也不能随意增大，一般在005095，用香柏油（油镜）可达15，用溴萘可近16。这样，光镜的最大分辨力R=（061550）/16=209（nm）（约为可见光最短波长的一半）。 所以，R=02m是光镜的极限，显微镜无论制作的如何精密，都无法突破这一极限。 0.61 R n sin n: 聚光镜和物镜之间 介质的折射率. 空气为1,油为1.5 : 标本对物镜镜口 张角的半角. sin的最大值为1 :照明光源的波长. 白光为0.5 m3 放大倍数/率（magnification）：M 是最终成像的大小 与原物体大小的比值（指长度）目镜放大倍数MF目=

13、250mm （明视距离）/F目（目镜焦距）物镜放大倍数MF物= 160mm ( 标准光学筒长) /F物(物镜焦距)总放大倍数MF总= 标准光学筒长/F物 250/F目 = 物镜放大率目镜放大率 M 是否越大越好？怎样提高M ？最大放大倍数 人眼的分辨率( 200 m )光镜的分辨率( 0.2 m ) =1000倍F目不能太短，因人眼瞳孔要与出射光孔重合，在10 mm以上，放大率不高，约在（250/10）25，光学筒长（A）不能无限长，所以只有靠减小F物来提高总放大倍数。光镜有效放大倍数受到分辨力限制，只要将R=0.2m，放大到人眼分辨力（0.2 mm）大小，便能观察该物体。0.2 mm 103

14、/0.2m=103（倍），超过此界限继续放大，人眼就看不清其细节，是模糊的空放大，无意义。 一般 光学显微镜的最大放大率只能是透镜的数值孔径的1000倍。透镜的数值孔径的范围是1.01.4，所以光学显微镜在用空气作介质时最大放大倍数为1000倍，用油镜则为1400倍。 有效放大： 上限：物镜镜口率1000 ； 下限：物镜镜口率250； 可变光阑（光圈）可调节开孔大小使聚光镜的N.A适应于物镜的N.A，如果聚光镜的N.A小于物镜N.A，则造成物镜NA不能充分发挥。正确匹配目、物镜，以保证物象清晰度。显微镜适合的放大倍数 决定于物镜的数值孔径，一般应为NA的 500-1000倍，M=NA（500-

15、1000）。 在选择放大倍数时，一定注意镜头的匹配，在物镜与目镜的组合中， 目镜有效放大倍数为： M=目镜倍数（O）物镜倍数（B） OB=NA（500-1000） O=NA（500-1000）/B。4 焦点深度 在视野中垂直范围内能观察到的界限。也就是调焦看清楚某一物点时，不仅这一点清楚，此点的上下两侧也能看清楚，能看清楚的厚度称为焦点深度。以下式表示： d=Kn/MNA K常数，约0.24mm； M为总放大倍数； n为介质折射率 从上式看出，放大倍数愈高，数值孔径愈大，则焦点深度愈浅5 工作距离 指从物镜镜面表面到盖玻片上表面之间的距离。在物镜孔径一定的条件下，工作距离越小，孔径角就愈大，数

16、值孔径也越大，所以高倍镜工作距离很小。6 镜像亮度和视场亮度 镜像亮度：指镜下图像的亮度。 视场亮度：镜下整个视场的明暗程度。除与目、物镜有关外，还与 聚光镜、光阑、反光镜和光源有关。7 反差（contrast） 指观察物与背景的对比程度。在光镜和电镜有所不同。在光镜（光学像）： 由于被检物各部分结构不同，因而吸收或反射光线强弱程度差异而引起“亮度差”或“色度差”。 在电镜（电子像）： 由于被检物各不同部位对入射电子具有不同散射度而引起“浓淡差”。（电子束基本上是单色光，它与被检物之间不产生色的反应，在像中显示出来的仅是浓淡差别）。从整个生命科学的发展趋势看细胞 生物学方法分子水平 细胞水平结

17、构功能 细胞生命活动分析 综合功能基因组学研究是细胞生物学研究的基础与归宿（生命科学研究的核心问题）显微观察细胞培养分子生物学技术组织学技术胚胎学技术生物化学技术物理学技术细胞生物学研究方法取材与固定：保持材料新鲜，使活细胞组成成分、物质固定，代谢停止，常用的有鲍威氏法、福尔马林固定脱水与透明：先用蒸馏水洗涤冲洗后，再脱水，用30%的酒精冲洗，把胞内水分逐渐替换出来，并防止萎缩；透明剂的作用是下一步顺利进蜡，二甲苯能把材料组织细胞中酒精替换出来进蜡与包埋：用石蜡溶液进入细胞代替二甲苯，一般在温箱石蜡溶液中；包埋就是放在冷水环境中很快使石蜡凝固，使组织变得坚硬，便于切片 切片： 切片机上进行脱蜡

18、: 10-15分钟；1/2二甲苯和1/2酒精纯酒精95%酒精- 85% - 70%各23分钟染色：番红、醋酸洋红，染色424小时封固：中性塑胶，盖片风干Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。用途：观察未经染色的玻片标本倒置显微镜 物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。暗视野显微镜 dark field microscope聚光镜中央有挡光

19、片，照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的可观察 4200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍观察物体轮廓透射式电子显微镜的基本结构 1 电子束照明系统 包括电子枪和聚光镜。有高频电流加热钨丝发出电子，经高电压使电子加速，经聚光镜汇聚成电子束2 成像系统 包括物镜、中间镜及投影镜组成。物镜直接将样品放大，中间镜和投影镜进一步把物镜的像放大。 物镜、中间镜、投影镜均为电子透镜（磁透镜），它是沿一光轴呈旋转对称的电磁场，可使从轴上一点发出的电子，重新会聚在中心轴的另一点上。 磁透镜是由一只大的电磁圈组成，好像一个螺旋管，当电流通过时

20、便可产生磁场，磁场对电子来说是折射介质。4 观察记录系统： 投影镜下面的观察室中装有荧光屏，显现出标本的电子显微像，便于观察。同时装有自动拍摄系统，以便把显示图像拍摄下来供观察分析。3 真空系统 镜筒中的高速电子和气体分子间的相互作用，与气体分子间的相互作用一样，会使高速电子散射而偏离直线；此外，电子枪中存在气体会产生电离和放电，引起电子束的不稳定或闪烁，还会腐蚀灯丝；再者，真空可保护透镜和防止标本污染。所以，电子显微镜的真空度越高越好，一般采用104乇（torr）相当于107大气压。 基本要求 1 细胞精细结构保存良好，不产生明显的物质凝聚、丢失或添加人工效应等； 2 切片厚度在500埃左右

21、，最大不超过1000埃（1mm厚的样品切成20000片；一个一般大小的细胞要切成300片） 颜色 厚度（埃） 暗灰色 400 灰色 400500 银色 500700 金黄色 700900 紫色 900以上 3 切片应耐受电子束的轰击，包埋介质不发生变形； 4 切片应具有良好的反差； 5 切片需均匀，没有皱褶、刀痕及染色剂沉淀等缺陷一、超薄切片技术 1 缓冲液 1）磷酸缓冲液 2）二甲砷酸钠缓冲液 2 固定液 1）戊二醛固定液 2）2%锇酸贮存液 3）高锰酸钾液 4）多聚甲醛液 3 支持膜（液） 4 染色液 1 缓冲液 维持细胞与固定液之间的平衡，消除细胞内释出的氢、氧离子，保持固定液的PH值在

22、正常生理值范围内。常用磷酸盐、柠檬酸盐、砷酸钠液 1）磷酸缓冲液 配制固定液用，该缓冲液对组织无毒害，不易产生假象，对细胞膜、核保存好，使细胞基质致密均一。（一）各种试剂制备配 法 甲液：0.2M磷酸二氢钠溶液 NaH2PO42H2O 31.2g 蒸馏水加至 100ml 乙液：0.2M磷酸氢二钠溶液 Na2HPO42H2O 53.61g 或 ( Na2HPO47H2O 53.65g Na2HPO412H2O 71.64g ) 蒸馏水加至 1000 ml 将甲、乙两液按下表混合，则成不同pH的0.2M磷酸缓冲液。 pH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 甲液 13.3 18.8 2

23、4.5 30.5 36 40.5 乙液 30.7 31.2 26.5 19.5 14 9.5有些实验要避免磷的干扰，则选用二甲砷酸钠缓冲液，即：配制0.2M的二甲砷酸钠缓冲液。 甲液： 二甲砷酸钠 21.4 g 蒸馏水加至 250 ml。 乙液： 0.2N HCL 按下表混合，并加蒸馏水至100ml，便得不同PH 的0.2M缓冲液， pH 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 甲液 50 50 50 50 50 乙液 13.3 9.3 6.3 4.2 2.7 本液稳定，可长期存放使用2）二甲砷酸钠缓冲液2 固定液 1）戊二醛固定液 常用浓度2.5% 2）2%锇酸贮存液 锇酸，即四氧化锇（Os

24、O4）是一种 淡黄色结晶，具有强烈的刺激味，其水溶液是中性的。 配方： OsO4 2g 加双蒸水溶解成100ml 配法：一定在通风橱内操作。锇酸有强烈毒性，对粘膜和角膜有固定作用。使用前几天，先将成品锇酸安瓶上标签洗去，用洗液浸泡12hr，再将安瓶固定在玻棒一端，（以避免用手接触安瓶）放入烧杯中自来水冲洗干净，后用蒸馏水彻底冲洗，卫生纸吸干水分，放入通风橱，戴上橡胶手套，用沙砖在安瓶颈部划一痕，插入棕色磨口瓶中折断，连同安瓶一并放入，瓶内预先放好所需蒸馏水，仔细摇匀后用指套套住存放备用。用时与等量0.1mol/L的磷酸冲液（pH7.4）混合即可。目的：使大分子交联而保持固定，不至在后面过程中移

25、位或丢失。机理：可与蛋白质的游离氨基形成共价键，将邻近蛋白分子交联。3）高锰酸钾液 4）多聚甲醛液3 支持膜（液） 1）火棉胶膜； 2）碳膜； 3）0.25%Formvar聚乙烯醇缩甲醛氯仿液 将市售氯伤(分析纯)在60电热套上重蒸馏(通风橱中进行) Formvar 250mg 经蒸馏的氯仿 100ml 密闭后保存干燥器备用4 染色液 醋酸双氧铀染液 50%（或70%）乙醇（或丙酮） 100ml 醋酸双氧铀 2g 在棕色磨口瓶中混匀溶解，低温暗处23天后取用上清液5 包埋剂目的：包埋使组织变得坚硬,便于切片。机理：可进入细胞内，起支持作用。 1）国产环氧树脂配方 618#环氧树脂 5ml 顺丁

26、烯二酸酐 2g 邻苯二甲酸二丁脂（DBP） 1.52ml 二乙基苯胺 0.4ml 依次加入溶解均匀，备用 2）进口环氧树脂EPON812配方 甲液（较软）：EPON812 10ml DDSA（十二烷基滤酸酐） 16ml 乙液（较硬）：EPON812 10ml MNA（六甲酸酐） 9.8ml 存于冰箱，用时混匀。冬季：甲乙=46 夏季：甲乙=37 用注射器将甲、乙两液混合，再以总体积的1.52%之比加入DMP30（二甲氨基甲苯酚）充分搅拌均匀，封好备用。5 包埋剂1 取材 2 初固定3 漂洗 4 再固定（二）制片过程要求： a .动作迅速；b. 材料体积小于1mm3；c. 机械损伤要小（刀锋利动

27、作轻巧）；d. 取材部位准确；e .操作最好在低温（04）处进行。迅速解剖动、植物组织，将其放在滴有戊二醛（冷）的卡片纸上，用锋利刀片切成0.51mm3小块，放入盛有冷戊二醛的小称量瓶中固定3小时以上（低温4）用PH7.0（植物）、7.2（动物）磷酸缓冲液冲洗3次以上(12hr)，以除去游离的与组织结合不牢的固定液(游离醛)；戊二醛易与锇酸形成一种细小颗粒而污染整个切片。 在通风橱内弃去漂洗液，加入适量配好的锇酸，塞上瓶塞，固定2hr，使材料变黑。目的：使大分子交联而保持固定，不至在后面过程中移位或丢失。机理：可与蛋白质的游离氨基形成共价键，将邻近蛋白分子交联。双重固定法：单用锇酸不能很好的保

28、护糖元及其它碳水化合物；戊二醛与锇酸相互取长补短，固定效果更好。较好地保存胞内主要化学成分5 再漂洗 弃锇酸于废液瓶中，加适量缓冲液漂洗3次，每次15，以后移出通风橱。漂洗的目的是洗净多余的锇酸，以免与下步脱水时所用乙醇作用发生沉淀。6 脱水 组织块分别经过50%、70%、80%、90%、95%上行梯度酒精各20，再经过三次100%酒精各10，当天完不成脱水过程时，可停在70%酒精中存放。脱水？ 常用包埋剂是非水溶性的，只有将细胞中的游离水分彻底清除之后，非水溶性的包埋剂才能渗入7 浸透 用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外所有的空隙都被包埋剂充填。 1/2脱水剂（100%Alo）+1/

29、2稀释剂（环氧丙烷）2040 稀释剂环氧丙烷 20 1/2稀释剂（环氧丙烷）+1/2包埋剂 1hr 包埋剂过夜或12天，温度20。梯度酒精脱水？ 急剧的脱水会引起细胞收缩8 包埋9 固化 包埋好的胶囊，在60温箱中加温固化2436hr，使完全聚合硬化，制成包埋块。10 切片 在超薄切片机上进行。在着手进行超薄切片前，尚需完成制备支持膜、修整包埋块及制作玻璃刀等工作。 热胀式超薄切片机： LKB型(瑞典)常用; Reichert OmV2型(奥地利) 机械式超薄切片机： Perter-Blum型； Sotvall MT/5000型(美国)； Huxley型（英国剑桥）； UM-3型（日本）。 1

30、）支持膜的制备 最常使用200目（3 mm）的铜网。用前需经丙酮清洗几遍，然后再用无水酒精洗几次，以彻底去除油污。挑选清洗好的铜网，尚需在其上覆盖一层薄膜（小于200埃），即支持膜。常用碳膜、火棉胶膜或Formvar膜（孚尔膜），即聚乙烯醇缩甲醛。 支持膜的制备 修块 制作玻璃刀 制作水槽 捞片11 染色 目的：增强样品中各种结构图象之间的反差或选择性地显示某些结构或成分。 方法：采用醋酸双氧铀（细胞核、结缔组织）柠檬酸铅（细胞质）双染法。A.选择性染色 苏木精细胞内核酸的分布 伊 红细胞质染色B.特异性染色 酶 + 底物 抗原 + 抗体基本原理 又称冷冻蚀刻，冷冻复型（freeze-repl

31、ica）、冷冻断裂（freeze-fracture）是一种由冷冻断裂与复型相结合的样品制备技术。最早由Hall，G. E.（1950）首先提出，直到1957年才由Steere用于生物样品的制备。现已成为电子显微镜技术中一个独具特色的分支，并得到广泛的应用。 该技术是采用冷冻的方法使样品迅速固定硬化，然后在真空中切断，升温使冰升华，暴露出断面结构（蚀刻）。再在切面上喷镀一层铂碳投影膜，然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica），捞至钢网上在电镜下观察。冰冻蚀刻技术（freeze etching）4 基本步骤 样品固定冷冻断裂蚀刻复型剥离捞膜观察。下面以动物材料为例，说明操

32、作过程。 1）样品预处理 切成小条（长3mm，宽1-1.5 mm）； 2）削制碳棒及烧制铂珠; 3）样品冷冻 a、断裂装置组装好，入液氮冷冻。b、将样品修整好装入样品杯的孔中，用自制小铝提勺入液氮中冷冻。冷冻结束后（停止沸腾）迅速将样品杯放入样品座的凹槽内，再一块入液氮。 4）断裂 冷冻结束，迅速将提蓝移到真空喷镀仪中开机抽真空，使真空度达到310-5托，此时温度约在-100110。速板动拉杆使支撑块滑脱，刀座即下滑将样品切断。5）蚀刻 加温使其保持在-96100，真空度在110-5310-6托，断面上的冰即开始升华，持续约60秒左右。 6）制作复型 首先以断面45度角喷铂碳，有必要的反差，约

33、需23秒。然后再以90度角喷碳，以加固复型。每次1秒，间隔34秒，共喷45次。 7）剥离 将样品小心取出放在次氯酸钠溶液中腐蚀。 8）捞取观察将复型膜小心捞至铜网上，染色后在TEM观察分析。5 复型电镜图象的辨认（Branton命名法）E半膜（extra-cellular half）：指与细胞外间隙或细胞内间隙（相邻的半膜。P半膜（protplasmic half）：指与细胞质、核质及线粒体基质相邻的半膜。 E半膜（extra-cellular half）：指与细胞外间隙或细胞内间隙（核周隙、线粒体内外膜之间隙、内质网及各种泡状结构的腔隙）相邻的半膜。 P半膜（protplasmic half

34、）：指与细胞质、核质及线粒体基质相邻的半膜。 当将生物膜（如细胞膜）劈裂后，便形成四个不同的面： 原有的两个面（亲水面）（自然面） P半膜上PS（protoplasmic surface） E半膜上ES（extracellular surface） 新形成的两个面（疏水面）（劈裂面） P半膜上PF（protoplasmic fracture face） E半膜上EF（extracellular fracturu face）复型电镜图象的辨认扫描电镜的基本结构 1 电子学系统产生扫描电子束，包括： 电子枪 由阴极、栅极、阳极组成，钨丝做成发叉式，发出直径为30m的电子束斑。 电磁透镜 不起放大作

35、用，只起缩小电子束斑直径的作用，将来自电子枪的30m的电子束斑，经过第一、二聚光镜及物镜的缩小作用，形成一直径为几十埃的扫描电子束，即扫描电子探针。 2 扫描系统 其作用是使电子束作光栅状扫描。 3 电子信号的收集、处理和显示系统（1）信号种类：在样品室中，扫描电子束与样品发生相互作用后产生出多种信号，各种信号为特定的检测系统检测后，可形成不同的图像并用于不同的目的。主要有二次电子、背反射电子、X射线、吸收电子、俄歇电子等。 1）二次电子：指被入射电子所激发出来的样品原子中的外层电子，它产生于样品表面以下几十埃到几百埃的区域，其产率主要取决于样品的形貌和成分。是研究样品表面形貌的最有用的电子信

36、号。 2）背反射电子：是入射电子在样品中受到原子核的卢瑟福散射后被大角度散射（反射）回来的电子，它产生于样品内部约1000埃的深度，它所形成的图像的衬度主要取决于样品中的原子序数。利用背散射电子的衍射图像可研究样品的晶体学特征。 3）X射线：广义指波长在10-5埃100埃（波长在0.1埃1埃的称硬X射线，波长在1埃10埃的称软X射线），是样品原子中的内层电子被入射电子电离后所发出的一种光，产生于5000埃左右的样品深部区域，不同的元素可以发出不同的特征X射线，据此可对样品进行成分分析。通常情况下原子处于基态，即在原子核周围； k壳层有2个电子； L壳层有8个电子； M壳层有18个电子 如果被加

37、速了的电子对这种处于基态的原子进行轰击时，则该原子便会发生电离，换句话说，就是原子核周围的电子当中有的被打出了原子层外，把这种能量高的状态称激发态。 当有能级较高的外壳层电子落入如此产生的电子空位上时，便会放出波长相应于其能量差的X射线。如图b所示。 4）俄歇电子：样品原子中的内层电子被入射电子束激发而电离后流下空穴，此时高能级上的电子必然要向低能级跃迁以填补空穴，电子从高能级向低能级跃迁时势必释放能量，这种多余的能量可以以辐射形式释放（即产生特征X射线），也可以使另一外层电子从样品表面逸出，以这种方式逸出的二次电子叫俄歇电子。（2）信号收集与处理 以上各种信号分别被特定的检测器所检测。使信号

38、电子转变成光信号，在光电倍增管中，光信号被转变成电信号，再经前置放大及视频放大，电流信号转变成电压信号，最后被送至显像管的栅极。 信号电子（检测器）光信号（光电倍增管）电信号电压信号显像管。（3）信号显示与记录 电压信号送到显象管栅极上，调制显象管的亮度。显象管中的电子束在荧光屏上也作光栅状扫描，并且这种扫描运动与样品表面的电子束的扫描运动严格同步，这样既获得衬度与所接收信号强度相对应的电子象，反映出样品表面的形貌或成分的特征。（4）真空系统（5）样品室与台 综上扫描电镜工作原理： 电子枪电子束（2030 m）第一、二聚光镜物镜（汇聚作用）电子探针（几十埃）在样品表面扫描，激发出多种电子信号（

39、电压信号）检测器（捕获信号，经放大、转换）电压信号调制显象管亮度显示图像照相记录。核酸大分子的制样技术 （大分子铺展技术，Kleinschmidt法） 核酸（DNA RNA）是遗传信息的载体和传递者，长期以来，人们都在努力探索通过电子显微镜对其进行直接观察，直至1959、1962年才由Kleinschmidt及Zahn等介绍核酸大分子的电镜制样技术，这方面工作从此打开了一个新局面。 2. 试剂配制 （1）上相液： 细胞色素C 0.1g/ml 核酸（DNA） 0.5g/ml1g/ml 醋酸铵 0.52M 成为核酸加到由细胞色素c所组成的、含有高浓度盐的溶液，也称展开液（2）下相液： 重蒸水或0.

40、050.25M的醋酸铵，是一种低浓度盐溶液1. 原理 许多碱性球蛋白可以在低盐溶液或蒸馏水表面形成不溶解的变性薄膜，如果蛋白质的浓度与所用体积合适，这层膜就可扩展成单分子层而形成由伸展的肽链构成的蛋白质分子网，由于肽链上有大量氨基酸碱性侧链基因，因此带正电的碱性蛋白质分子包围着带负电的核酸分子，当碱性蛋白质在溶液表面展开成单分子层时，核酸分子也同时被拉开伸展在溶液的表面，然后捞至带支持膜的铜网上，再进行旋转投影或负染色，然后就可以在电镜下观察。3 操作过程 （1）展膜 将下相液注入洁净培养皿，再把洁净载片斜放在培养皿中，倾上相液，在距下相液表面1cm处轻轻滴到斜面上，让其沿斜面缓缓流下。当流至下相液表面时，上相液就很快形成一层单分子膜（1mg蛋白质可展开形成