DHA和EPA在辅助治疗癌症中的最佳比例的探究

1、重庆医科大学学生创新实验项目 申 请 书 项目名称：DHA和EPA在辅助治疗癌症中的最佳比例的探究申 请 者： 贺强 陈进 杜志鹏 艾秋池 陈旭指导教师： 彭惠明单 位：实验教学中心电 话请日期 ：2010年 12月20 日重庆医科大学实验教学管理中心研究项目项目名称DHA和EPA在辅助治疗癌症中的最佳比例的探究所属学科申请金额 3500元起止时间2010年 12月至 2011 年 9月项目性质学生自选研究课题型或学生参与科研活动型（选其一）科研小组成员姓名性别年级电话及电子邮箱贺强男09heqiang199091陈进男09级13650512

2、809陈旭男09杜志鹏男09秋池男09导教师研究内容和意义简介(400500字)研究发现，作为一般乳制品和保健品常用成分的DHA和EPA有抗击癌症的功效，而且它们在与某些抗癌药物，如三硫化二砷，紫杉醇等联合起来作用时，使得药物的疗效有了大幅地提升！但是当前只研究了DHA和EPA分别同抗癌药物联合后的疗效，并没有将DHA和EPA以及抗癌药物三者共同联合起来研究。我们猜想，将三者联合起来会有更好的疗效，而且DHA和EPA不同的比例和浓度对疗效有不同的提升。在本实验中，我们把培养皿内的白血病细胞和被植入白血病瘤块的小鼠作为

3、实验对象，将DHA和EPA以及三硫化二砷制成药剂，通过改变DHA和EPA的相对比例和它们在药剂中的含量，做出比例梯度和含量梯度曲线，从而得到DHA和EPA在辅助三硫化二砷治疗癌症过程中的最佳比例和含量。需解决的问题：肿瘤细胞的培养，肿瘤的移植，肿瘤细胞的检测方法。本实验的意义：三硫化二砷因有较强的毒副作用，在治疗癌症时其治疗范围和用量非常有限，如果本实验获得成功，那么三硫化二砷单位浓度内的癌细胞杀伤效果将得到提升，从而降低因对其使用过量而对患者造成的伤害，这也为扩大三硫化二砷的肿瘤治疗范围创造可能；DHA和EPA使用过量也会对人体有害，实验的结果能确定一个合适的DHA和EPA用量，降低它们给患

4、者带来的副作用；此外，抗癌药物的价格都不斐，而本实验的结果对降低药物的生产成本和价格有帮助，从而减轻患者的经济负担；本实验结果还能为以后DHA和EPA联合其他抗癌药物的研究提供依据。立论依据(项目的研究意义和国内外研究现状分析，附参考文献)DHA和EPA：均为n-3多烯不饱和脂肪酸，是人体必需的高度不饱和脂肪酸。因为人体不能自行合成，只能从食物中摄取，在深海鱼油中含量较高。其分子结构式如下： （D H A） （E P A）纯 EPA和DHA均无色、无味，常温下呈液态，且具脂溶性，易溶于有机溶剂，都不溶于水，熔点分别为一5453和-455-441，所以在低温下仍然保持较高的流动性。目前，DHA和

5、EPA主要作为营养保健品和婴幼儿奶粉中的主要成分，备受广大消费者的青睐，效果良好。但若摄入量过多也会产生一些副作用，如体重减轻、血小板减少、头晕、恶心等一系列不良反应。DHA摄入过量可导致免疫力低下，而之前闹得沸沸扬扬的圣元奶粉致婴幼儿性早熟，据说也与其中的EPA有关，但目前还无足够的证据。目前已发现EPA和DHA的生理作用有：促进脑、视网膜形成和延缓脑的衰老；防止心血管疾病；抗炎、抑制过敏反应；特别是抑制肿瘤的生长。20世纪纪70年代人们对格陵兰爱斯基摩人和阿拉斯加地区居民进行饮食与疾病关系的流行病学调查时发现，虽然他们总脂肪和多烯不饱和脂肪酸(PUFA) 的摄取量与西方国家居民的平均水平相

6、近，但几种常见肿瘤的发病率却远低于西方国家。分析摄人脂肪酸的构成情况发现其中n一3 PUFA占较大比例。由此，n一3 PUFA，特别是DHA和EPA的抗癌作用引起了国内外学者关注，成为抗癌研究中的新热点。EPA和DHA抑制肿瘤生长的机理：1.亚油酸能促进癌症的发生，而DHA和EPA能降低肿瘤从血液中提取的亚油酸的数量。所有的-6系列脂肪酸都会促进癌肿的生长，但目前为止亚油酸的作用是最强的，很少数量的亚油(油食品)酸就能提高癌肿的生长速度，其数量越多，癌肿生长速度增加得就越快。DHA和EPA能降低癌肿从血液中提取的亚油酸的数量，使癌肿戒除了一种其非常需要的营养物质，以这种方法钝化了有促进癌症发生

7、功效的亚油酸的作用。2.DHA和EPA能抑制肿瘤细胞内环氧酶一2的活性，减少前列腺素的产生，从而发挥对肿瘤的抑制作用。肿瘤细胞内环氧酶-2的活性明显增强，而环氧酶-2的表达可增加前列腺素的合成，可导致前列腺素的含量明显高于正常组织。前列腺素能诱导细胞增殖并刺激能抑制细胞凋亡的Bcl-2蛋白的表达，因而使细胞增殖和凋亡失衡，促进肿瘤的发生。前列腺素也能促进细胞外基质降解，产生血栓烷促进血小板聚集，有利于癌细胞的侵袭和转移。DHA和EPA能够抑制鱼油组磷脂酶 A2(PLA2)、磷脂酰肌醇-磷脂酶C(PI-PIC)以及COX-2的活性。PLA2能在环氧酶-2的作用下生成前列腺素，促进肿瘤的发生、侵袭

8、和转移，PI-PLC激活后能够促进瘤细胞的增殖。3.DHA和EPA阻止了细胞表面黏连分子的作用，并阻碍溶解基底膜所必须的胶原酶的产生，让癌细胞无法渗透到血管和淋巴中。癌细胞要想从原发部位扩散到其他部位，就必须渗透到血管及器官周围的基底膜中，DHA和EPA可阻止细胞表面黏连分子的作用，缺少了这种必要的“抓钩”癌细胞就不容易黏附在基底膜上，就算癌细胞将自己黏在了基底膜上，DHA和EPA也还可以阻止溶解基底膜所必须的胶原酶的产生，让癌细胞无法渗透进去。 4.DHA和EPA 可经过一定途径结合到癌细胞线粒体膜上，加重其对活性氧的敏感性，引起癌细胞线粒体膜电位下降，使癌细胞发生凋亡。更为重要的是，DHA

9、或者EPA与经典抗癌药物（如三硫化二砷，阿霉素，紫杉醇等）联合治疗时，其疗效比它们单独使用时有了大幅度的提高！其主要机理是：在与药物联合治疗程中，DHA和EPA改变了肿瘤细胞膜磷脂的组成，增强了药物的渗透作用，从而提高了单位浓度药物的疗效。 与此同时，DHA和EPA改变了过氧化底物和抗氧化物之间的平 衡，使肿瘤组织对脂质过氧化更为敏感，从而增强药物的毒性。本实验主要研究与三硫化二砷联用的作用。三硫化二砷（As2S3）：为红色或黄色单斜晶体，微溶于水，溶于乙醇和碱溶液，通常用作颜料、还原剂、药物等。天然的三硫化二砷又称作雌黄。其结构与著名的有毒物质砒霜（As2O3）比较相似，因此它也有比较强的毒

10、副作用，在一定条件下，可以转化为砒霜，方程式如下： As2S3 + O2 As2O3 + SO230多年前，人们发现三硫化二砷(As2S3)通过促使细胞内活性氧(R0S)的累积诱导凋亡，从而对多种白血病细胞产生作用。但因其在有效血药浓度时毒副作用较大，目前还仅限用于急性早幼粒细胞性白血病的治疗中。目前As2S3治疗白血病的现状及进一步研究的原因：Sturlan S等在其实验中将l u mol As2S3和25 umol DHA作用于HL-60细胞，实验发现：As2S3和DHA分别作用于HL一60细胞时，细胞活力分别下降了142 %和3082% ，而二者联合使用可使HL一60细胞活力下降870

11、%。并得出DHA辅助As2S3治疗白血病的机理：DHA结构中含有多个双键结构，在体内氧化物质的压力下发生脂质过氧化，As2S3作用下产生的R0S加强这种作用，并导致过氧化产物和R0S的进一步累积，引发细胞线粒体膜电位的下降，细胞色素C被释放出来，随后接连联激活Caspase家族的若干蛋白质，最终发生细胞凋亡，这提示与DHA的联合作用，有可能降低As2S3的有效治疗浓度，扩大其对白血病的治疗作用谱。但是，当前的研究中，只是研究了DHA和EPA分别同抗癌药物联合后的疗效，并没有将DHA和EPA以及抗癌药物三者共同联合起来作用的研究。我们可以有根据地猜想：将、和As2S3三者联合起来会有更好的疗效。

12、我们在海洋科学杂志上看到一篇题为真鲷仔稚鱼微粒饲料中DHA与EPA最佳比例的研究的报告：饲料中的DHA和EPA的比例会直接影响到海水仔稚鱼的生长速度、成活率、应激能力和体内相关成分。而目前国内外还没有在对临床上对用于辅助治疗白血病的DHA和EPA的最佳比例的研究，由此我们想到：既然DHA和EPA的比例对鱼类的生长有影响，那会不会对辅助治疗白血病也是如此呢？因此我们提出猜想：DHA和EPA在辅助药物治疗的过程中，癌症疗效仍然有上升的空间，DHA和EPA两者不同的比例，不同的浓度，对抗癌药物疗效的提升有不同的潜力。项目研究的意义：三硫化二砷因有较强的毒副作用，在治疗癌症（尤其是血癌）时其治疗范围和

13、用量非常有限，如果本实验获得成功，那么三硫化二砷单位浓度内的癌细胞杀伤效果将得到提升。因此以后的临床过程中，在保证疗效的前提下，治疗者可以减少三硫化二砷的使用量，从而减轻其在治疗过程中给患者正常细胞带来的杀伤，这样就能更健康，更人性化地治疗癌症；同时，三硫化二砷的肿瘤治疗范围也将得到扩大；此外，DHA和EPA使用过量会降低细胞粘黏度和脂肪的释放能力，从而可能引起凝血功能不足和脂肪肝，所以实验的结果也能确定一个合适的DHA和EPA用量，降低它们给患者带来的副作用；从患者作为消费者的角度来看，抗癌药物的价格都不斐，而本实验的结果能减少药物的使用量，从而降低药物的生产成本和价格，减轻患者的经济负担。

14、此外，实验结果还能为以后DHA和EPA联合其他抗癌药物的研究提供依据参考文献：法发现补充DHA脂肪酸可增强癌症放疗效果，中科院网，2007-7-20鱼油能够对抗阿尔茨海默症，新顾问网，2009-8-31 -Amyloid Oligomers Induce Phosphorylation of Tau and Inactivation of Insulin Receptor Substrate via c-Jun N-Terminal Kinase Signaling: Suppression by Omega-3 Fatty Acids and Curcumin，Greg Cole，Journ

15、al of Neuroscience杂志，2009-7-15 omega-3脂肪酸可延缓癌症发展，甚至可避免癌症转移，智利第三版时报，2010-11-17鱼油可以防止乳腺癌细胞转移到骨， HYPERLINK /science/journal/0006291X 生化和生物物理研究通讯 HYPERLINK /science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%236713%232010%23995979995%232693749%23FLA%23&_cdi=6713&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000051998&_versio

16、n=1&_urlVersion=0&_userid=1205919&md5=b904b4ff047e08feeb8b3b49cf47158c 卷402，第4期，2010-11-26 DHA和EPA的抗癌机制研究进展，刘艳，预防医学文献信息 2004年3月第1O卷第2期走近DHA，刘莹，大学化学第25卷增刊，2010-4浅谈EPA和DHA的生理作用，赵春艳，西藏科技2010年7期(总第208期)二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸研究的综述，丁兆坤，张海柱，徐友卿，中国科技论文在线，2007年2月第2卷第2期真鲷仔稚鱼微粒饲料中DHA与EPA最佳比例的研究，刘镜恪,陈晓琳,周利,霁霖，海洋科学2004年

17、第28卷第2期二、研究方案1.研究目标、研究内容、研究方法： 1.1 研究目标:将DHA、EPA和三硫化二砷组成混合药剂，使其作用于培养皿中的血癌细胞和小鼠瘤块的相关部位，探究作为抗癌辅助药物的EPA、DHA的最佳比例及在最佳比例下的DHA、EPA的最佳浓度。1.2 研究内容：1.2.1 血癌细胞的培养及患血癌小鼠模型的建立：将取得的血癌瘤块注入小鼠的皮下，待瘤块长大到一定体积后，选取一只小鼠，剥出瘤组织，进行体外培养，得到血癌细胞，其余小鼠作为活体实验研究对象。1.2.2 生长周期的观测（细胞培养实验组相关）：取适量血癌细胞在一个培养皿中培养，在不同的时间段检测其生长情况，记录相关数据，大致

18、确定稳定增长期。1.2.3 实验相关处理： A.细胞培养实验处理：一个实验组（每组十个培养皿）及一个对照组（一个培养皿）在上述已加入基底物的培养皿中植入等量的血癌细胞，待生长一段时间后，在各个实验组中分别加入含不同比例EPA和DHA的混合药剂（EPA+DHA+三硫化二砷），在适宜条件下进行培养。 B.活体小鼠实验处理： 一个实验组（二十只小鼠，雌雄各半，）及一个对照组（两只小鼠，雌雄各半），选取已建立实验模型的小鼠为研究对象，对实验组小鼠分别注入含不同比例EPA和DHA的混合药剂（EPA+DHA+三硫化二砷），再将小鼠置于适宜条件下饲养。1.2.4 检测:通过对1.2.2中生长曲线的分析，选取

19、一个处于稳定增长期的时间点，并在此时间点用MTT比色法对细胞培养实验组和相应对照组的每一个培养皿的肿瘤细胞进行检测，并记录相关数据。而对于活体小鼠实验组，在标准时间点，对小鼠的相关部位进行肿瘤切片技术处理，获取实验信息，统计并记录相关数据。1.2.5 数据处理： a.细胞培养实验组：用医学统计学分析并处理所得到的数据，绘制“吸光度EPA和DHA的比例”曲线，再对曲线分析得出细胞培养实验组的初级最佳比例。得到初级最佳比例后，在该比例区域内对其进行“放大”，即把其分成九组更精细的比例组，用18只小鼠（雌雄各半）再次进行A的实验处理，得出细胞实验组的最佳比例。 B.活体小鼠实验组：用医学统计学分析并

20、处理所得到的数据，绘制“镜下单位面积癌细胞数EPA和DHA的比例”曲线，再对曲线分析得出活体小鼠实验组的最佳比例的大致范围，在此范围内再分为更为精细的九组，再按B实验处理，进行“放大”实验，进一步得出活体小鼠实验组的最佳比例。1.2.6 二期实验处理：首先复制“1.2.3 实验相关处理”中A、B处理步骤的实验组和对照组，在取得的最佳EPA、DHA比例下，通过改变EPA和DHA的总体浓度，对实验对象进行上述（A、B处理步骤、检测、数据处理）操作后，大致得出EPA和DHA的最佳总体浓度的范围，在这个范围内再分为更为精细的九组，按上述相同的处理进行放大实验，最终分别得出在最佳的DHA和EPA比例下，

21、体外和体内EPA和DHA的最佳总体浓度。2.拟解决的关键问题：1）肿瘤细胞培养技术2) 肿瘤块的体内植入3）药剂的配置4）MTT比色法对肿瘤细胞的检测技术 5）活体小鼠肿瘤切片技术及相关计数操作3.研究技术线路：(见下页)在最佳比例的大致范围内细化分组，重复以上实验，得出EPA、DHA最佳比例获取血癌肿瘤细胞在最佳比例的大致范围内细化分组，重复以上实验，得出EPA、DHA最佳比例获取血癌肿瘤细胞植入小鼠皮下体外实验体内实验移植到生长观察培养皿移植到实验组培养皿细胞观测其生长周期细胞移植到对照组培养皿细胞取出部分小鼠瘤块放入培养皿中处理剩余小鼠分为实验组对照组组，雌雄各半培养一段时间加入三硫化二

22、砷及不同比例的DHA、EPA加入等量三硫化二砷实验组对照组加入三硫化二砷及不同比例的DHA、EPA加入等量三硫化二砷培养一段时间检测肿瘤细胞的数目统计数据并绘图讨论并得出EPA、DHA最佳比例大致范围第一期实验在最佳浓度的大致范围内进行放大实验，得出EPA、DHA在最佳比例下的最佳浓度得出DHA、EPA在最佳比例下的最佳浓度大致范围在最佳浓度的大致范围内进行放大实验，得出EPA、DHA在最佳比例下的最佳浓度得出DHA、EPA在最佳比例下的最佳浓度大致范围加入三硫化二砷及最佳比例下不同浓度的DHA、EPA加入等量三硫化二砷加入三硫化二砷及最佳比例下不同浓度的DHA、EPA加入等量三硫化二砷对照组

23、检测肿瘤细胞的数目统计数据并绘图培养一段时间培养一段时间移植到实验组培养皿细胞移植到对照组培养皿细胞实验组取出部分小鼠瘤块放入培养皿中处理剩余小鼠分为实验组对照组，雌雄各半体外实验体内实验植入小鼠皮下获取血癌肿瘤细胞第二期实验4.可行性分析：1）本实验所需要的药物EPA和DHA及三硫化二砷均可联系厂家获得。药物的配制也属于基础化学实验的内容，相应的器皿和检测仪器以及小鼠均可由实验中心提供。2)肿瘤细胞的培养、MTT比色法技术、活体小鼠肿瘤切片技术及相关镜下细胞计数操作均可在老师的指导下实现。3）该实验课题具有创新性以及社会实用价值，研究方法，技术路线，实验方案均符合科学原理。5.技术关键： 1

24、）肿瘤细胞培养技术 2）MTT比色法 3）活体小鼠肿瘤切片技术及相关肿瘤计数操作6.研究工作进度安排：2011.3.12011.3.14 联系厂家购买实验所需药物。20113.152011.3.30A：练习肿瘤细胞培养技术，熟悉MTT比色法，肿瘤切片技术的操作B：确定正式实验时各实验组的混合药剂中EPA和DHA的比例，细化实验的分工安排。2011.4.12011.6.6A：进行实验，取得数据。B：进行数据分析，得出结论。2011.6.72011.7.7对实验结果进行总结，撰写结题报告。7.本实验特色和创新：研究方向的创新：DHA和EPA对癌症有良好的辅助治疗作用，而且DHA和EPA本身也有一定

25、的抗癌功效。但是目前还没有对于DHA和EPA在辅助治疗癌症中的最佳比例及最佳比例下最佳用量的探究。本实验将填补这方面的空白，为以后的研究提供参考数据。研究过程的创新：本次试验采用三种药物联合实验，分两期进行，不同期实验交换研究变量，而且不同变量之间存在紧密联系，二期实验变量由一期实验研究结果确定，这样可以更科学、更全面地分析DHA、EPA的辅助作用，以便达到更好的实用价值。课题意义：如果本实验获得成功，将为下一步临床实验提供可能，从而为临床上抗癌药物的剂量选择提供一个可靠的参考数据，提高药物治疗效率，在一定程度上为更为人性化的癌症药物治疗做出一点贡献。8.预期研究结果： 1）不同比例的EPA和DHA在辅助药物治疗癌症的过程中效果一样。2）不同比例的EPA和DHA在辅助药物治疗癌症的过程中效果存在无规律性差异，但无最佳比例。 3）不同比例的EPA和DHA在辅助药物治疗